Диссертация (1151292), страница 28
Текст из файла (страница 28)
Фокусировка лучевого пятна в плоскости объекта обеспечивала диаметр 5 мм. Специальным измерением была определена плотностьмощности световой энергии в лучевом пятне в плоскости объекта. При обоихсветофильтрах она достигала 0,125 мкВт/мм2. При измерении без светофильтровплотность мощности световой энергии в лучевом пятне оказалась около 0,6мВт/мм2.В излучателе И-4 был применен источник линейчатого спектра – ртутнаялампа сверхвысокого давления «ДРТ-120». Для выделения длин волн 405нм и365 нм были использованы те же светофильтры, что и в излучателе И-3.
Кюветное отделение так же было аналогично излучателю И-3. Фокусировка луча в И-4обеспечивала 100% заполнение кюветного отделения световым пятном (диаметрпятна 8 мм). На обеих длинах волн обеспечивалась плотность мощности энергиисветового пятна 2 мкВт/мм2.Приведенные характеристики излучателейпозволяли нам произвестирасчет доз световой энергиии, падающей на облучаемые образцы спермы.Для случаев облучения в стационарном режиме общее количество световойэнергии, падающей на исследуемые образцы, рассчитывали по формуле:W = P × S × t , где:Р - мощность падающего излучения в мВт/мм2;S – площадь светового пятна в плоскости образца, мм2 ;t – длительность экспозиции, секунды;W – суммарное количество световой энергии, падающей на облучаемыйобразец , мДж.Облучение в стационарном режиме проводили только на излучателях И-1 иИ-2 при экспозиции 5 минут.
Таким образом, при диаметре светового пятна 5157мм общее количество упавшей световой энергии на образец составило:- излучатель И-1 –0,3 Дж;- излучатель И-2 – 0,6 Дж для обоих вариантов фокусировки луча.Однако, условия облучения существенно различаются, в зависимости отфокусировки луча (Рис.13). При диаметре светового пятна 1,5 мм облучаетсянебольшая зона образца – около 6% площади поверхности содержимогоэппендорфа, а при диаметре светового пятна 5мм – около 70%. С другойстороны при диаметре пятна 1,5 плотность падающей энергии 2,83 мВт/мм2 (И1) и 5,66 мВт/мм2 (И-2), тогда как при диаметре пятна 5 мм 0,25 мВт/мм2 (И-1) и0,5 мВт/мм2 (И-2).Рис.13. Схема фокусировки лучаа) – диаметр светового пятна 1,5 мм; б) – диаметр светового пятна 5 мм.1—эппендорф с образцом спермы; 2 – луч лазера (вид сбоку и вид сверху).При облучении в проточном режиме дозу световой энергии, упавшую наединицу объема образца, рассчитывали по формуле:W = (1/V) × 0,0625 × D × d4 × π2 × P × К , где158V скорость подачи жидкости через каппиляр (мм3/с);D – диаметр светового пятна (мм);d – диаметр каппиляра (мм);Р – плотность мощности световой энергии излучателя в световом пятне(мВт/мм2);π - 3,14; К – коэффициент размерности ( мм-3);W – суммарное количество световой энергии, упавшее на каждыйэлементарный объем облучаемого образца мДж/мм3.При облучении в проточном режиме для всех излучателей при диаметресветового пятна 5 мм, скорость подачи жидкости через каппиляр составляла 33,3мм3/с; диаметр капиляра во всех исследованиях также был одинаков – 0,75 мм.При таких параметрах каждый единичный объем находится под действиемизлучения 0,07 с.
Поэтому расчет дозы упрощается:W = 0,44 × 0,07 × P = 0,03 × P [мДж/мм3]Результаты расчетов доз приведены в таблице 12.Таблица 12 - Расчетные значения доз световой энергии, упавшихна единицу объема спермодозы при проточном облучении в зависимости оттипа излучателя (для диаметра светового пятна 5 мм).ИзлучательИ-1И-2И-3И-4Доза , мкДж/мм37,5150,0040,06При диаметре светового пятна 1,5 мм каждый единичный объем спермынаходился под действием излучения 0,02 с. Все расчетные значения, показанныев таблице 1, в этом случае следует уменьшить в 3 раза.Анализ качества спермы проводили по стандартным методикам наавтоматических спермоанализаторах«AndroVision» и «Biola-AFS-500».
В159качестве показателей учитывали изменение величин: % общей подвижности(ОПД), %прямолинейно поступательной подвижности (ППД),% быстрыхклеток, общую (среднюю) скорость движения мкм/с, % неподвижных клеток(НПД).Все исследования проводили на базе ФГБОУ ВО МГАВМиБ-МВА имениК.И. Скрябина.2.6.1. Оценка качества облученной спермы по морфологическимпоказателямВоздействие лазерного излучения в стационарном режиме на эякулятпосле криоконсервации. В племцентре ГЦВ (Подолский р-н, Московской обл.)было получено 2×0,25 мл замороженной (770К, две «соломинки»)спермыбыка с исходным количеством клеток в дозе -37 000 000.
Сперма разморожена вполном соответствии с условиями ГОСТ 322-77-2013. Затем спрму разбавляли2,9% раствором цитрата натрия до объема 2 мл. Разбавленную сперму разливалипо эппендорфам, в каждый по 0,5 мл. Сразу после разбавления проводилиисследование на спермоанализаторе. Далее половину образцов подверглиоблучению при 405 нм с использованием излучателя И-1 при экспозиции 5минут, диаметре светового пятна 5 мм. После облучения (в течение 30–60 с)облученный образец исследовали на спермоанализаторе. Затем, все образцыспермы как облученный, так и контрольный помещали в термостат (380С) и синтервалами 20–30 минут, в течение 5 часов, из образцов отбирали пробы дляспермоанализатора.Динамика показателей представлена в таблице 13 и на рисунках 14-16.
Исследование опытного и контрольного образцов в каждой временной точке занимало около 5 минут.Таблица 13 - Динамика показателей качества спермы в процессе инкубациипосле размораживания и облучения в стационарном режиме (лазер 405 нм,0,25 мВт/мм2)№ВремяДлительностьКонтрольОпыт160воздействия, ч13.0013:1413:3313:4714:0514:2315:3117:1712345678воздействия,мин01433475679147253ОПД,%5248495953494528ППД,%3330323934292814контрольНПД.%4852434046505473ОПД,%51414838443722ППД,%3228302027239НПД.%48585261556277опыт6055% ОПД50454035302520050100150200250время, минутыРис. 14.
Динамика общей подвижности сперматозоидов в процессеинкубации посде размораживания и облучения300161опытконтроль4035% ППД30252015105050100150200250300время, минутыРис. 15. Динамика прямолинейной поступательной подвижностисперматозоидов после размораживания и облучения в стационарномрежимерруропытрконтроль807570% НПД6560555045403530050100150200250300время, минутыРис. 16. Динамика % неподвижных клеток в процессеинкубации после размораживания и облучения в стационарном режимеИз представленных результатов видно, что облучение в стационарном режиме по всем определяемым показателям снизило способность сперматозоидов162к переживанию в процессе инкубации после размораживания.
Вместе с тем, тенденция к снижению показателей в среднем достигала 10% после облучения иустойчиво прослеживалась в процессе всего периода инкубации.Воздействиелазерногоизлучениявстационарномрежименасвежеполученный эякулят. Сперму получали в племцентре ГЦВ (Подольскийр-н, Московской обл.) стандартным способом (садка на чучело) от быкапроизводителя (бык «Эрик»), в объеме 5 мл. Сперма была разбавленастандартнымсинтетическимразбавителем«OptiXcell»доконцентрацииклеточных тел 50 000 000 /мл ± 10%. Полученный разбавленный эякулят разлилипо эппендорфам по 0,25 мл. В процессе инкубации после облучения определеяликонцентрацию клеток (С млн./мкл), прямолинейное поступательное движение(ППД, %), % быстрых клеток (% БК), общую (среднюю) скорость движения,мкм/с. (ОСД).Результаты исследования представлены в таблице 14 и на рис.
17-19.Таблица 14 - Динамика показателей качества свежевзятой спермы впроцессе инкубации после облучения в стационарном режиме(лазер 405 нм, 0,25 мВт/мм2)№ Время Длительнвоздейостьствия, воздействчия,мин1 13:1002 13:25153 14:45954 16:05175С,млн/мл50±550±550±552±5контрольППД БК%%48484233,734352617ОСДУ.е.ОпытСППД БКмлн/%%млОСДУ.е.10510487,56650±550±550±510487,565,947,235,3203223,38,9163опытконтроль5045% ППД4035302520020406010080120140160180200время, минутыРис. 17. Динамика прямой поступательной подвижности сперматозоидов впроцессе инкубации после облучения в стационарном режимеконтрольопыт3732% БК272217127020406080100120140160180200время, минутыРис.
18. Динамика % «быстрых» клеток в процессе инкубации послеоблучения в стационарном режиме164опытконтроль110105100СК, у.е.9590858075706560020406080100120140160180200время, минутыРис. 19. Динамика средней скорости сперматозоидов в процессе инкубациипосле облучения в стационарном режиме.Опыт и контроль совпадаютНаоснованиипроведенныхисследований,установленоснижениекачественных показателей облученной спермы по сравнению с контрольной.Таким образом, воздействие лазерного излучения оказывает угнетающеевлияние на переживаемость половых клеток независимо от способа храненияспермы (криоконсервацияи или свежеполученной).
В то же время концентрацияклеток и средняя скорость их движения в сравниваемых группах не имелидостоверных отличий.Воздействиелазерногоизлучениявстационарномрежименасвежеполученный эякулят, окрашенный флуорохромом. В племцентре ГЦВ(Подолский р-н, Московской обл.) получена сперма стандартным способом(садка на чучело) от быка-производителя (бык «Резус»), в объеме 5 мл. Еёразбавлялистандартнымсинтетическимразбавителем«OptiXcell»доконцентрации клеточных тел 35000000 /мл±10%. Полученный разбавленныйэякулят разливали по эппендорфам по 0,25 мл, в каждый эппендорф (кроме«чистого контроля» добавляли по 7,5 мкл флюрохрома «Hoechst 33342/pi».165Условия проведения лучевого воздействия и инкубации были полностьюаналогичны, описанным выше.
Отличие заключалось восуществлении«двойного контроля»:- из них первый образец окрашивали флуорохромом, вопытной группе окрашенный образец подвергали воздействию лазера.В процессе инкубации после облучения определеяли концентрацию клеток(С млн./мкл), прямолинейное поступательное движение (ППД, %), % быстрыхклеток (% БК), среднюю скорость движения, мкм/с.
(ССД).Результаты исследования представлены в таблице 15 и на рис. 20-22.Таблица 15. Динамика показателей качества свежевзятой спермы в процессеинкубации после обработки флуорохромом Hoechst 33342/pi и облучения встационарном режиме (лазер 405 нм, 0,25 мВт/мм2)ПоказательС, млн/мклППД, %БК, %ОСД, мкм/сС, млн/мклППД, %БК, %ОСД, мкм/сС, млн/мклППД, %БК, %ОСД, мкм/сВремя исследования, ч / длительность воздействия, мин11.30/011.40/1012.45/75Опыт (флуорохром+облучение)2927.74941,235,827,310198,7Контроль-1 (чистый)36.432,536,846,15549,2203934,872,8105102Контроль-2 (+флорохром)3635,847,543,631,735,8103101-13.45/13532,637,124,9873753,839,3983842,829,694166контроль-1контроль-2опыт60% ППД5550454035020406080100120140время, минутыРис. 20. Динамика прямой поступательной подвижности сперматозоидов,окрашенных флуорохромом, в процессе инкубации после воздействиялазерным излучением в стационарном режимерф у рруконтроль-1рконтроль-2ропыт403836%, БК3432302826242220020406080100120время, минутыРис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
