Диссертация (1151292), страница 31
Текст из файла (страница 31)
Выявлены случаи завоза спермопродукции со сниженным биологическим качеством (половые клетки с аномальнойформой, сниженной подвижностью и т.п.), которые были контаминированы воз-186будителями условно-патогенной микрофлоры.Тестированию «золотым стандартом» на: P. aeruginosa, E. coli, Staphylococcusspp., Streptococcus spp., Mycoplasma spp., Campilobacter spp. подвергали образцыспермопроб, положительно отреагировавшие по результатам ПЦР исследований.При исследовании 222 образцов спермодоз методом бактериологических посевов был зафиксирован рост Campilobacter spp в 14,8% образцах, в 62 образцахспермы из отечественных племцентров и 36 образцах спермы зарубежных хозяйств выявлен рост микроорганизмов рода Mycoplasma spp., что составляет42,7% от их общего количества; из 232 образцов спермы 2,6% были контаминированы P.
Aeruginosa. Результаты представлены в таблице 23.Таблица 23 – Результаты микробиологических исследованийспермопробВид инфекцииКоличествоисследованныхобразцовБактериологический посевСексированнаяЗарубежногоОтечественнаяКокковая инфекция23200P. aeruginosa23203Единич.колонии впределахГОСТ3E. coliMycoplasmaspp.Campilobacterspp.232229000360622220543.1.1.
Контаминация спермы быков-производителей бактериями родаМycoplasma187Материалом служили 246 образцов криоконсервированной спермопродукции быков-производителей коммерчески значимых пород мясного и молочногонаправления, из них 120 проб отечественного происхождения и 126 – зарубежного производства.Для культивирования микоплазм использовали специальные дифференциальные микробиологические агаровые питательные среды: PPLO бульон с ростовыми добавками с кристаллическим фиолетовым и PPLO агар фирмыHimedia (Индия).При подборе питательной среды для культивирования и вы-деления микоплазм в образцах спермы были использованы среды PPLO BrothBase w/CV V268. Среда М268 с добавлением лошадиной сыворотки в 20% случаев не позволили получать/выделить микоплазму.
Среда М268 с добавлениемдобавки FD0075, которая содержала лошадиную сыворотку, дрожжевой экстракт, бензилпеницилин и талия ацетат позволила выделять микоплазму в образцах спермопроб.Микроскопическое исследование выделенных микоплазм проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа Vega II LMN.Таблица 24 - Результаты выделения Mycoplasma spp. из спермы(2017 – 2018 гг.)Страна-поставщикКоличествоспермодозМетод выделения и процентноесоотношение микоплазмБак.посев%Россия1036260,1США421740,4Канада421228,5Великобритания42716,6Из подвергнувшихся исследованию 229 образцов наибольшее количествообсемененных (60,1%) было выявлено в сперме быков отечественного производства и 84% зарубежного. Образцы были протестированы бактериологическимметодом.
Рост был подтвержден в 98 образцах (Табл. 24).188Рис. 36. Рост Mycoplasma spp., выделенной из спермы, в полужидких обогащенных средахВ полужидких обогащённых ростовыми добавками питательных средахмикоплазмы растут по уколу, образуют крошковатые колонии различной конфигурации, равномерно распределенные по внутренней части пространства в видесветящихся комет (рис. 36).На плотных питательных средах микоплазмы формируют характерные колонии, напоминающие по форме яичницу - глазунью (рис. 37).Рис. 37.
Структурная организация колонииMycoplasma spp. на плотной питательной среде189по результатам фазово-контрастной микроскопии. х100 (под эмерсионныммаслом)Структурная организация культуры Mucoplasma spp. представлена на рис. 38.Рис. 38. Сканограмма культуры Mycoplasma spp. х 20 микрометровИсследованием в сканирующем электронном микроскопе фрагментов колоний микоплазм, выращенных на поверхности мембранных фильтров, установлено, что популяция представлена плотно упакованным в виде бугорков кластером, погруженным в межклеточный матрикс (рис. 39).190Рис.
39. Структурная организация симбиоза кокковой флоры и микоплазмы. СЭМ. Х 20 микрометров.При большом увеличении видно, что структуры колонии микоплазм состоятиз организованных рядов плотно упакованных бактерий, при малом увеличениивыявлено образование массивных складчатых структур. Также выявлено большое число свободно лежащих кокковидных клеток различного размера.Описанный морфологический пейзаж изучаемого образца спермы позволилпроследить морфологические изменения микоплазм – репродукция «транзитарно-симбиотических» кокковидных и L- форм в определенных условиях сопровождается реверсией в плотно упакованный матрикс микоплазмы с восстановлением свойств морфофенотипии, что можно рассматривать, как стратегический191маневр выживании популяции при неблагоприятных условиях.Рис. 40. Микроколонии в стадии деления, контаминирующие микоплазму.Световая микроскопия, х1000.Данные, полученные с помощью электронной микроскопии, выявили изменения цитоархитиктоники микоплазм, что свидетельствует о запуске процессадеструкции микроорганизма (Рис.
40).192Рис. 41. Полиморфизм микоплазм. Х 1000.Он выражается в отпочковании элементарных телец в виде небольшихгрупп гомогенных электронноплотных сферических шаровидных тел эллипсовидной формы - субмикроструктур (сферулы) с ровными контурами и диаметром 0,30-0,80 мкм, которые довольно четко просматриваются на общем фонеизображения.
(рис.41).Сравнительный анализ эффективности метода ПЦР и бактериологическогометода при выделении из спермы микоплазм, позволил нам разработать алгоритм исследования спермопроб быков-производителей на микоплазмоз (рис. 42).193Рис. 42. Алгоритм исследования спермы на микоплазмозПредложенная схема проведения лабораторного контроля спермопродукциина микоплазмоз, включает:- первичное тестирование спермодоз методом ПЦР;- культивирование положительных образцов на дифференциальных питательных средах;- окончательное тестирование культур с подтвержденным ростом методомПЦР.Разработанный алгоритм исследования спермопроб быков-производителейна микоплазмоз является современным методологическим подходом к диагностике данного заболевания крупного рогатого скота и имеет важное противоэпизоотическое значение, так как способствует разработке эффективных мероприятий по профилактике и борьбе с болезнями животных, вызываемых микоплазменными микроорганизмами.На основании проведенных исследований разработаны и утверждены вустановленном порядке методические рекомендации «Ветеринарно-сани-тарныйконтроль качества замороженной спермы быков-производителей.
Методы194микробиологическогоанализазамороженно-оттаяннойспермыбыков-производителей» (МУ от 21.12.2018 г).3.1.2. Мониторинг выявляемости бактерий рода Campilobacter из спермы,поступающей в РФ из-за рубежаМатериалом для исследований служили 222 образца криоконсервированнойспермопродукции быков-производителей коммерчески значимых пород мясногои молочного направления, из них 103 пробы отечественного и 119 – зарубежногопроизводства.Для культивирования кампилобактерий использовали специальные дифференциальные микробиологические агаровые питательные среды: бульон Болтенаи среду Престон фирмы Himedia (Индия).Идентификацию микроорганизмов рода Campylobacter проводили такжереференсным методом с использованием галереи стрипов API системы (Франция) с прилагаемыми к ним средами-суспензиями и реактивами для учета реакции («Золотой стандарт»).
Интерпретацию полученных результатов осуществляли при поддержке программного обеспечения APIWEB (Франция).Результаты идентификации кампилобактерий сравнивали с данными, полученными с помощью масс-спектрометра MALDI BRUCER.Микроскопическое исследование выделенных кампилобактерий проводилис помощью электронной модуляционной интерференционной микроскопии насканирующем электронном микроскопе Vega II LMN.При изучении морфологических особенностей, выделенных кампилобактерий было установлено, что большинство клеток имели S-образную форму, некоторые из них располагались локально в форме запятой, их жгутики состояли изтонких нитей и исходили из кратерообразного углубления, а длина варьировалав среднем в пределах 3,5 мкм у исследованных штаммов и превышала таковуюбактериальной клетки.195Таблица 25 - Результаты выделения кампилобактерий из спермыСтрана- Количест Campylobacteпоставщиквоr spp.спермодоз спермоБак.
посевдозC.fetusC.JejuniБак.посевБак.посевРоссия1031806США307013США29 (сексированная)000Канада30309Великобритания305010При исследовании образцов спермы бактериологическим методом «Золотойстандарт» с использованием галереи стрипов API и сличительными даннымибиблиотеки микроорганизмов масс-спектрометра MALDI BRUCER, в 6 образцахиз 103 проб отечественного семени была обнаружена C. Jejuni, что составило5,8% от общего количества проб. Из 119 проб зарубежной спермы C. Jejuni былаобнаружена в 32 образцах, что составило 27,0% (табл. 25, 26).Таблица 26 - Процентное соотношение патогенных и непатогенныхкампилобактерий, выделенных из спермы быков-производителейСтрана -поставщикРоссияСШАСША (сексированная)КанадаВеликобританияКоличествопроб10330293030Campilobacter.spp., %10093,3070,053,3C.fetus,%00000C.jejuni,%5,814,301,411,3Таким образом, сперма, поступающая в РФ из-за рубежа, обсеменена патогенными кампилобактерами на 21,2% больше, чем отечественная.196Нами усовершенствован алгоритм диагностического исследования спермопроб быков-производителей на кампилобактериоз, который включал следующиеэтапы:1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
