Диссертация (1151292), страница 35
Текст из файла (страница 35)
Ген SUOX кодирует молибдогемопротеинсульфит-оксидазу- конечный фермент при окислении серосодержащих аминокислот, которыйиграет важную роль в остеогенезе.Больныетелята(гомозиготыпомутантномуаллелю)обычномертворожденные или погибают в первые часы после рождения. У животныхрегистрируют изменения в костной системе (череп, позвоночник, конечности),возможны мышечная атрофия и пороки сердца. Поражения конечностейхарактеризуются: удлинением и истончением костей (долихостеномелия, «ногипаука»), их переломами во время отела, что может повредить матку и родовыепути, деформацией суставов, позвонков, что приводит к кифозу и сколиозу.Деформации лицевого отдела черепа включают брахигнатию (недоразвитиенижней челюсти), короткий череп с вмятиной на верхней челюсти («указательголова»).
По данным литературы, частота носителей составляет 3,3%.Проведен анализ нуклеотидной последовательности гена-мишени SOUX попубличнымбазамассоциированныйсданных(GenBank).даннымгенетическимВыявленучастокзаболеванием.генома,Выбраныисинтезированы олигонуклеотидные праймеры, позволяющие амплифицироватьфрагмент (размер 503 п.н.) гена SOUX Bos taurus в области мутации.AS.F5’ – GGTCAGAGTGAGGTAGAGTGAT - 3’AS.R5’ – CCACGTTAGGTACAGGCAAATGA - 3’Проведена оптимизация условий ПЦР. Были выбраны следующие условиятермоциклирования «SАA 60оС»:предварительная денатурация 95оС – 5 мин (1 цикл);95оС – 10 сек60оС – 10 сек35 циклов72оС – 15 секзаключительная элонгация 72оС – 5 мин (1 цикл).225МК-1234567891011 12 13 14•Рис. 61.
Оценка аналитической чувствительности праймеров,используемых для амплификации фрагментов гена SOUXДля определения аналитической чувствительности праймеров использовалираствор плазмидной ДНК c известной концентрацией (2,33x1013 копий/мл),содержащий клонированный фрагмент гена SOUX Bos taurus размером 503 п.н, атакже серию десятикратных разведений растворов плазмидной ДНК в ТЕбуфере, с концентрациями от 2,33х107 до 2,33х10 копий/мл. Результатыпредставлены на рисунке 61 и обобщены в таблице 28.Таблица 28 – Результаты оценки аналитической чувствительностипраймеров, используемых для амплификации фрагментов гена SOUX№образца1234567891011121314Наличие фрагмента генаSOUX, размер 503 п.н.+++++++++++-Наименование образцаДНК гена SOUX, концентрация2,33х107 копий/млДНК гена SOUX, концентрация2,33х106 копий/млДНК гена SOUX, концентрация2,33х105 копий/млДНК гена SOUX, концентрация2,33х104 копий/млДНК гена SOUX, концентрация2,33х103 копий/млДНК гена SOUX, концентрация2,33х102 копий/млДНК гена SOUX, концентрация2,33х10 копий/мл226Аналитическая чувствительность праймеров, используемых в методике дляамплификации фрагментов гена SOUX, составила 2,33х103 копий/мл.
В качествеположительного контроля ПЦР (К+) для идентификации мутации «AS» вдальнейшем использовали разведение 2,33х104 копий/мл.Для проверки накопления ПЦР-продукта и оценки его концентрациипроводили электрофорез в агарозном геле (рисунок 62).МК+К-Кв5/11 6/11 7/118/11 9/11Рис. 62. Результаты электрофоретического анализа ПЦР продуктовгена TUBD1 Bos taurus в области мутации «SАA».Образцы № 5/11 - № 9/11 - ДНК, выделенная из спермы животныхПри идентификации мутации SAA результат интерпретировали наосновании вставки одного нуклеотида G (гуанин) в определенном положениигена SOUX: c.
363–364 insG p.Ala124Gly.Для идентификации мутации «SАA» было проанализировано 19 образцовспермы и крови от разных животных. Животных – носителей данной мутациивыявлено не было.Генетические аномалии, обнаруженные у бурой швицкой породы, отраженыв таблице 29.227Таблица 29 - Генетические аномалии, обнаруженныеу бурой швицкой породы крупного рогатого скотаSDMСпинальнаяДемиелинизациявсего носитель1503SMAСпинальнаямышечнаяатрофиявсего носитель1507WBH2SAAДегенеративная Гаплотип 2Синдроммиелоэнцефалобуройарахномиелиипатияшвицкойвсегоноси- всего носит всего носительельтель150215021500Установлено, что у бурой швицкой породы наиболее часто встречаетсятакая генетическая аномалия, как SMA (спинальная мышечная атрофия),встречаемость которой у зарубежных племенных быков составляет 4,7%,спинальная демиелинизация выявлена у 2% быков.С использованием данной методики в 2017 г в рамках оценкираспространениягенетическиханомалийукрупногорогатогоскотаголштинской породы были получены данные, представленные в табл.
30.Таблица 30 - Генетические аномалии, обнаруженныеу голштинской породы крупного рогатого скотаBYБрахиспинальныйсинлромCVMBLADDUMPSCITFXIDКомНедостат Недостат ЦитрулДефицитплексококлинемиифактораныйсвертыадгезииУридинпороклейкацитмонования XIпозвоночовфосфатникасинтетазывсе но все но все но все но все но все но болгосит госит госит госит госит госи еетельельельельельтель151 2 191 4 213 1 203 0 218 0 231 11CDHДефицитхолестеринавсего238носитель10Как следует из данных таблиц 29 и 30, генетические аномалии у буройшвицкой и голштинской пород различаются по своей природе.У голштинов наиболее часто обнаруживаются такие генетические228аномалии, как дефицит холестерина (4,2%) и комплексный порок позвоночника(2,1%).Разработанные молекулярно-генетические методы идентификации мутаций,ассоциированных с наиболее распространенными наследственными патологиями у крупного рогатого скота, позволили выявить в сперме быковпроизводителей, поступающей в РФ из-за рубежа, такие генетические аномалии,как брахиспинальный синдром, комплексный порок позвоночника, недостатокадгезии лейкоцитов, недостаток уридинмонофосфатсинтетазы, цитруллинемию,дефицит фактора свертывания крови XI, дефицит холестерина.На основании проведенных исследований разработаны и утверждены вустановленном порядке методические рекомендации «Идентификация мутаций,ассоциированныхснаиболеераспространенныминаследственнымипатологиями крупного рогатого скота голштинской породы, молекулярногенетическими методами» (№ МЭ 1/0029 от 3 февраля 2017 года).4.2.
Оценка качества спермы Бельгийской бело-голубой породы крупногорогатого скотаБельгийская бело-голубая порода крупного рогатого скота (ВВВ) – это мясная порода, выведенная животноводами Бельгии.Разведение чистопородной Бельгийской бело-голубой породы в Россиивозможно, но в ближайшем будущем, так как этот проект требует высоко технологичного ветеринарно-зоотехнического сопровождения (Рис. 63).Рис. 63. Племенные быки Бельгийской бело-голубой породы229Оптимально реализуемым проектом в РФ является технология кроссбридинга, основанная на искусственном осеменении спермой ВВВ местных молочных и мясных пород скота и ветеринарно-санитарный контроль при искусственном осеменении этих животных.
Контроль будет включать в себя изучение биологического, эпизоотического и генетического профиля.Сперму ВВВ начала завозят в Российскую Федерацию из Бельгии в 2017 ги, как новый для нашей страны генетический материал, подвергают всестороннему исследованию.От ООО «Мировет», имеющей лицензию на ввоз спермы ВВВ в Россиюю,было получено по 5 спермодоз от 5 быков-производителей по кличкам LONI-M,SACHARA JACOB, SОTTI-M, PERSAN DE PETIT ROSIERE И FELS-M.Мониторинг качества спермы Бельгийкой бело-голубой породы был изученнами и представлен в виде протоколов чек-листов.Экспертизу генетического материала этой породы проводили стандартизированными современными методиками, согласно требованиям ГОСТ 260302015.Изучены морфологические свойства сперматозоидов этой породы с цельюопределения размеров, наличия мертвых форм спермиев, определения количества с анормальной структурой, изучена подвижность спермиев, исследованацелостность их акросомы, определен индекс фрагментации ДНК спермиев вспермопробе после ее размораживания, а также микробная загрязненность наразные виды бактерий и грибов.В работе использовали разработанные и усовершенствованные нами методы.Для определения содержания спермиев изменённой формой и наличием посторонних включений применяли методику подготовки и окрашивания согласнометодическим рекомендациям «Биологическое качество криоконсервированнойспермы КРС», а также систему прибора AndroVision®: CASA программноеобеспечение с ПК (рис.
64).230Рис. 64. Система AndroVision®На рис. 65-71 представлены чек-листы с результатами исследований спермыВВВ.Рис. 65. Результаты определения подвижности сперматозоидов быка FELSM231Рис. 66. Морфология сперматозоидов быка FELS-MРис. 67. Результаты определения подвижности сперматозоидов быка LONIM232Рис.
68. Морфология сперматозоидов быка LONI-MРис. 69. Результаты определения подвижности сперматозоидов быкаPERSAN DE PETIT ROSIERE233Рис. 70. Результаты определения подвижности сперматозоидов быка SОTTIMНаоснованииполученныхчек-листковипротоколовприбораAndroVision®: CASA был проведен анализ образцов спермопроб ВВВ по показателям подвижности и концентрации, который показал, что все подвергнутыеэкспертизе спермопробы породы Бельгийской бело-голубой соответствовалинормам ГОСТ.Концентрация сперматозоидов после размораживания была выше по сравнению с показателями этого параметра других пород крупного рогатого скота исоставила от 85 до 103 миллионов спермиев в миллитре спермодозы.Диаграмма скорости сперматозоидов после размораживания, которая увеличивалась в геометрической прогрессии, является одним из факторов, подтверждающих высокую биологическую активность, оплодотворяющую эффективность и жизнеспособность спермы породы Бельгийской бело-голубой (рис.
70).234Согласно полученным протоколам морфофункционального профиля, количество неповрежденных сперматозоидов составило 50-60%, что выше среднихзначений по сравнению с аналогичными данными этого параметра у других пород (рис. 71).Рис. 71. Морфологические осоенности сперматозоидов быка SACHARA JACOBКоличество спермиев с отделившимися головками составило у всех изучаемых образцов спермопроб ВВВ - 3%, столько же сперматозоидов с закрученными хвостами, количество спермией с согнутыми хвостами - 8,3 %, анормальныехвосты выявлены у 28%, что соответствует параметрам ГОСТ для спермы высокого качества.При изучении акросомальной реакции у спермиев ВВВ было установлено,что акросома сперматозоидов расположена в виде шапочки на переднем полюсеполовой клетки. Разработанный метод окрашивания акросомы позволил выявитьцелостность акросомы у сперматозоидов животных породы ВВВ.235Данные электронно-микроскопического исследования акросомы сперматозоидов быков Бельгийской бело-голубой в мазке из изучаемых спермодоз свидетельствут о высоком качестве ферментного аппарата и постакросомного сегмента, участвующего в прикреплении сперматозоида к яйцеклетке.Следовательно, все показатели соответствуют нормам регламента ГОСТ26030-2015.В результате изучения фрагментации ДНК сперматозоидов, генетическиханомалий не выявлено.При микробиологическом исследовании спермопроб от Бельгийской белоголубой породы, бактерии, вирусы и грибы не были обнаружены ни в одной изпроб.4.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
