Диссертация (1151292), страница 38
Текст из файла (страница 38)
По мнению директора ОАО«Уралплемцентра» доктора биологических наук Мымрина В.С., сегодня малокто обращает внимание на качество селекционного материала и последствия егоиспользования. Давление на сельхозтоваропроизводителей особенно усилилосьв связи с изменениями в селекционных программах США. Сбыт невостребованного семени быков принял просто массовый характер. Об этом убедительно свидетельствуют данные таможенной службы: средняя цена одной дозы осеменения, при вхождении на территорию России, составляет около 80 рублей, то естьчуть больше одного доллара США.По данным Мымрина В.С. (2016) и Ескина Г.В.
(2016), отмечено, что заслуга поставщиков североамериканской биологической продукции (спермы) для искусственного осеменения крупного рогатого скота сомнительна. Используя различные маркетинговые уловки, поставщики заокеанской спермы уговариваютспециалистов хозяйств применять бесконтрольное поглотительное скрещиваниес породами, выведенными совершенно в других климатических условиях, виных условиях содержания и эксплуатации животных. Это приводит к резкомуухудшению здоровья наших животных, уменьшению срока продолжительностихозяйственного использования, и в результате, снижению рентабельности отрасли.Установление морфофункциональных характеристик даёт нам ключ к рассшифровке структуру самого сперматозоида и является показателем его компе-250тентности не только в оплодотворении, но и в процессе эмбриогенеза.
В практическом животноводстве важно не только оплодотворение, но и рождение полноценного потомства. В этой связи данные спермограммы дают информацию лишьо наличии аномальных гамет, не позволяя при этом вскрыть мрфологическуюоснову их функциональной некомпетенции, тем более что сперматозоиды нормальной формы могут быть функционально неполноценными.Данные морфофункционального анализа позволяют количественно оценивать структурное состояние половых клеток, выявлять их нежизнеспособныеформы, определять целостность акросомы, индекс фрагментации ДНК сперамтозоидов.Анализ качества криоконсервированной спермы быков-производителей базировался в наших исследованиях на изучении морфофункциональных, биофизических показателей и биологических свойствах гамет.
Исследования включалиопределение концентрации половых клеток, объёма эякулята, подвижности половых клеток, их выживаемости и количества, сохранивших прямолинейнопоступательное движение после оттаивания и хранения в течение 5 ч в термостате при температуре 38° С;Неоспорим и тот факт, что современный этап развития биотехнологииобеспечивает обогащение популяции сперматозоидами заданного пола, при этомв настоящее время коммерческая эффективность достигнута в сочетании с такими репродуктивными методами, как осеменение «in vitro», классическое ICSI иискусственное осеменение в сочетании с суперовуляцией для последующеговымывания и пересадки эмбрионов.По данным Кысса И.С.
(2009), Чомаева А.М. (2012), Даленова Ш.Д. (2012)и др., показатель оплодотворяющей способности сексированного семени значительно варьирует по отдельным хозяйствам страны. Разница между хозяйствамисоставляет около 30%.Всемирно признанную пониженную результативность оплодотворяющейспособности объясняют повреждением спермы во время сортировки (J.O. Carvalho., 2010) и низкой концентрацией сперматозоидов в дозе (J.M. DeJarnette251et.al. 2009).Теоретические обоснования послужили предпосылками для проведенияэкспериментальных исследований спермопроб (разделенная и неразделенная пополу сперма). Полученные данные при решении этой задачи позволяют научнообосновать причину низкой результативности оплодотворения данным семенем,а также создать комплекс методических рекомендаций-алгоритм исследованиябиологических и микробиологических показателей качества спермы, в том числеи разделенной по полу.
В своих исследованиях мы использовали стандартизированные валидированныеметодики (обеспечения единства измерений №РОСС RU.0001.310354 от 27.03.2014 по аттестации методик (методов) измерений и метрологический экспертизе документов)и поверенное оборудование согласно соответствию требованиям ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009, а также в лицензированных и аккредитованных лабораториях по линии системы менеджментакачества(аккредитации)Испытательнойлаборатории(центра)№RA.RU.21ФВ02 от 08.02.2016 на соответствие требованиям ГОСТ ИСО/МЭК17025-2009).Совместно с доцентом кафедры биологической физики Новиковым Э.В.были сконструированы лабораторные модели излучателей, которые позволилиполучить новые данные о воздействии УФ-излучения на биомеханические показатели и подвижность сперматозоидов быков-производителей.Было показано, что при облучении в проточном режиме фотосенсибилизирующий эффект проявлялся в снижении до 40 % подвижности клеток в сравнении с контрольными образцами, а после 4 ч.
инкубации в термостате при t=38°С их подвижность снижалась до 23 %;Под воздействием УФ сперматозоиды приобретали активно-возбужденноесостояние, регистрируемое в виде хаотического движения, которое сменялось угнетением подвижности, что приводило к гибели половых клеток.Эффект облучения выражался в появлении сперматозоидов с закрученнымихвостами и клеток с измененным вектором движения, что фактически тождественно сличительным данным в экспериментальных работах профессора252Брагиной Е.Е.
(2017 г.)Следующим этапом нашей работы было усовершенствование экспрессметодов идентификации аномальных форм сперматозоидов. В доступной литературе нами обнаружено достаточное количество работ в данном направлении(В.П. Кононов, Н.А. Голышов, 1998 г., А.М. Чомаев, М.Н. Чернышев, В.Е.
Доровских, В.А. Афанасьев, 2003 г., G. Barroso., M. Morshedi., S. Oehninger, 2000,G. Ricci, S. Perticarari, E.Fragonas, E.Giolo, S. Canova, C. Pozzobon, S. Guaschino,Presan I, 2002-2004).Экспресс - метод идентификации аномальных форм сперматозоида весьмаинформативен для дифференциального распознавания присутствующих в тканяхструктур, которые после окрашивания можно выявлять по цвету при их последующем микроскопировании.Селективное окрашивание применяют для морфологической дифференциации нормальных и аномальных форм половых клеток. При этом тинкториальновыявляют головку семенной клетки, акросому, экваториальную область, среднюю часть и хвост. Благодаря экспресс-методу было установлено и доказано,что в сперме, поступающей из-за рубежа, в 80% исследуемых образцах спермопродукции несоответствие нормативным показателям ГОСТ 26030-2015.Для определения целостности акросомы нами был предложен и апробирован инновационный метод, сущность которого заключается в светооптическомопределении числа сперматозоидов с интактной или поврежденной акросомой.Целостность акросомы определяли с помощью дифференцированного окрашивания специальными красителями (Дифф-Квик).
Нельзя исключить, что повышенное содержание в сперме половых клеток с аномальной акросомой можетбыть причиной идиопатического бесплодия, даже при нормативных параметрахспермограммы. Важно, что метод позволяет надежно выявлять целостность акросомы, состояние ферментного аппарата половой клетки и постакросомногосегмента,участвующеговприкреплениисперматозоидакяцеклетке(Е.Е.Брагина, Е.Н. Бочарова, 2014, J. Ramalho-Santos., G. Schatten, R.D.Moreno,2002).253Результаты исследований с использованием предлагаемой нами методики(тест - набора Дифф-Квик) отличаются высокой степенью достоверности и являются более информативными по сравнению с другими методами окрашиванииакросомы сперматозоида животных-производителей (Приложение 4).Разработкой методики подсчета индекса фрагментации занимались:В.А.Багиров, В.П. Кононов, Б.А.
Иолчиев, П.М. Кленовицкий, Л.К. Эрнст(2012)., В.Новиков (1978), Sutovsky P., Manandhar G., Wu A., Oko R., 2003). Метод основан на определении индекса фрагментации ДНК в сперматозоидах и является технологически-современным методическим подходом к анализу маркеров апоптоза, которые играют важную роль в регуляции фертильности.Фрагментация ДНК сперматозоидов оказывает влияние не только на фертильность, но и на ранние этапы эмбрионального развития плода, особенно наформирование бластоцисты в предимплантационный период эмбриональногоразвития (то есть до нидации зародыша к стенке матки) (Приложение 17).Тест на структуру хроматина – метод SCSA позволяет определить степеньповреждения нитей ДНК (измерения количества разрывов ДНК) в сперматозоидах.Окрашивание клеток флуоресцентными красителями, то есть ДНК флюрохромами, происходит благодаря способности флюрохрома избирательно окрашивать двуспиральные нуклеиновые кислоты в самом сперматозоиде.Согласно нашим данным, все исследованные пробы спермы, разделеннойпо полу, не соответствовали ГОСТ Р 54633-2011, число сперматозоидов спрямолинейно-поступательным(Приложение14, 15,16).движениемНашисоставлялоисследованияменееподтвердили40%.снижениеподвижности сперматозоидов, а именно явление астеноспермии у всехисследуемых клеток и установили причину данного явления.Полученные результаты позволили нам, научно обосновать низкую результативность оплодотворения спермой, разделенной по полу, при применении искусственного осеменения животных в хозяйствах нашей страны, что коррелирует с данными, полученными из хозяйств центральной части РФ (Г.В.
Ескин 2010254г.).При использовании сексированного семени следует соблюдать специальныережимы, более того, количество в дозе половых клеток значительно меньше, чемв традиционных спермодозах. Надо отметить, что в процессе разделения спермыпо полу с помощью высокоскоростной проточной цитометрии сперматозоидыподвергаются действию неблагоприятных факторов: применение флюрохрома,высокая степень разбавления семени, лазерное излучение, давление, электромагнитное поле, центрифугирование (P. Klinc, D. Rath, 2006).Ряд авторов (Г.В. Ескин и др., 2010, Jr.G.E. Seidel et.al., 1999; J.M.
DeJarnette et.al., 2009) не находят особых преимуществ использования сексированногосемени при искусственном осеменении животных в отечественных хозяйствах.Поэтому исследования эффективности применения сексированного семени неутратят своей актуальности. Результаты зарубежных исследователей по применению сексированного семени выявили, что частота наступления стельности приэтом на 20% ниже, по сравнению с обычной спермой (Gagea, M.I., 2010)По данным А.М.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
