Диссертация (1151292), страница 41
Текст из файла (страница 41)
Разработан комлексный методологический подход к оценке качестваспермы быков-производителей, включающий анализ морфофункционального состояния гамет (наличие их аномальных и фрагметированныхформ, чехлика, фрагментированной минохондриальной ДНК), репродуктивнх параметров (внешний вид, объем, pH, подвижность, количесвоживых и мертвых клеток, их концентрация), генетических дефектов:брахиспинального синдрома, комплексного порока позвоночника, недостатка адгезии лейкоцитов, уридинмонофосфатсинтеазы, цитруллинемии, дефицита фактора свертывания крови, холестерина, а также микробиологических характеристик (наличие/отсутствие общего микробногочисла непатогенных микроорганизмов, бактерий из группы кишечнойпалочки, псевдомонад, кокков, микоплазм, кампилобактерий и грибов).2.
Модифицированный экспресс-метод идентификации аномальных формсперматозоидов позволил выявить в половых клетках, разделенных по полу, следующие патологические формы: отделившаяся головка - 23%, аномальная головка – 32 %, согнутые хвосты – 36%, закрученные хвосты – 33%.3. Разработанный экспресс – метод морфофункциональной дифференциации половых клеток с помощью селективного окрашивания тест-наборомДифф-Квик позволил получить объективные данные об их структурном ифункциональном состоянии. Сперматозоиды с поврежденной акросомойизменяют тинкториальные свойства и приобретают светло-розовый цвет,неповрежденные имеют коричневый оттенок.
При исследовании сексированного семени от 20 быков, у 19 животных средний показатель количествасперматозоидов с интактной акросомой составил 78%.4. Выявлен механизм фрагментации ДНК в головке и шеечной части сперматозоидов, определены пороговые (до 30%) значения индекса фрагментации нуклеиновых кислот, отклонения от которых свидетельствуют о мито-267хондриальной дисфункции, вызывающей астеноспермию. При исследовании проб сексированной спермы от 20 быков-производителей, завезенныхиз США, с использованием разработанного нами метода у 20 % быков обнаружен индекс фрагментации ДНК 31,2%, у 30% быков в сперматозоидахобнаружена фрагментированная митохондриальная ДНК – свечение хвостовой части (митохондриальная дисфункция). Число сперматозоидов спрямолинейно-поступательным движением составило менее 40%.5.
Разработаны модели лазерных излучателей, характеризующиеся различной длиной волны и мощностью, применяемые при сексировании половыхклеток согласно сортер-технологии, что позволило провести детальныйморфофункциональный анализ секированной спермы и выявить причиныастеноспермии и низкой оплодотворяющей способности половых клеток.6. Установлен фотосенсибилизирующий, флюрохромный и электромагнитный эффекты лазерного облучения на половые клетки быков, проявляющиеся вналичии у 41,5% сперматозоидов структурных и функциональных нарушений:гипоплазия головки, прореагировавшая акросома, электронно-прозрачная акросома, аномалии строения аксонемы жгутика, снижеие на 25-40% подвижностиспермиев в сравнении с контролем, что приводило к гибели половых клеток.7.
Усовершенствован метод выявления и идентификации возбудителей инфекционных болезней животных, контаминирующих сперму, заключающийся вподборе специальных дифференциальных микробиологических плотных и полужидких сред для культивирования микроорганизмов рода Mucoplasma (PPLOBroth Base w/CV - M268с добавлением добавки FD0075) , Campilobacter (галерия стрипов API), «медленно растущих» грибов (селективные микологическиепитательные среды PDA, DRBC, картофельно-глюкозный агар) с последующимизучением их структуной организации методами сканирующеей электронной,световой, фазово-контрастной микроскопии и морфометрии.8. На основании усовершенствованного метода идентификации возбудителейнаибольшее количество контаминированных микроорганизмами (163 из 229) исследуемых образцов было выявлено в сперме быков отечественного производ-268ства.
При этом наличие живых бактерий было обнаружено в 98 спермодозах; изних в 14,8% пробах были обнаруженны живые кампилобактеры C. Jejuni. Сперма, поступающая в РФ из-за рубежа, по степени обсеменённости патогеннымикампилобактерами превосходила на 21,2%, полученную из отечественных племхозяйств; рост грибов наблюдали в 43,75% образцах спермодоз. Видовой составвыделенных из спермы грибов был представлен Aspergillus niger (57,14%),Aspergillus flavus (14,29%), ассоциация Aspergillus niger и Mucor spp. (28,57%).грибы семейства Mucoraceae (42,86%).9.Разработанные молекулярно-генетические методы идентификации мутаций,ассоциированных с наиболее распространенными наследственными патологиями у крупного рогатого скота, позволили выявить в сперме быковпроизводителей голштинской и бурой швицкой пород, поступающей в РФ из-зарубежа, такие генетические аномалии, как брахиспинальный синдром, комплексный порок позвоночника, недостаток адгезии лейкоцитов, недостаток уридинмонофосфатсинтеазы, цитруллинемию, дефицит фактора свертывания кровии холестерина.
Выявленные наследственные аберрации имеют породную предрасположенность: у голштинов наиболее часто обнаруживается дефицит холестерина (4,2%) и комплексный порок позвоночника (2,1%), у бурой швицкой породы – спинальная мышечная атрофия (4,7%), спинальная демиелинизация (2%).Сведения о практическом использовании полученных научныхрезультатов1.
Расшифрован механизм фрагментации ДНК-хроматина сперматозоидов иопределены пороговые значения показателя фрагментации ДНК, позволяющиевыбраковывать спермодозы из оборота и применения для искусственного осеменения.2. Разработан экспресс-тест по определению структуры ДНК-хроматина дляанализа маркеров апоптоза половых клеток крупного рогатого скота, которыйпрошел лабораторные испытания и рекомендован РАН и ФГБУ ВГНКИ для269применения при оценке качества спермы.3. Разработан экспресс-метод окрашивания сперматозоидов с использованием красителя Farebi, позволяющий оценивать морфологические особенностиспермиев на целостность акросомы и проводить морфометрические исследования. Метод утвержден РАН и рекомендован ФГБУ ВГНКИ для применения приоценке качества спермы.4.
Составлен перечень болезней инфекционной и незаразной этиологии, атакже перечень генетических аномалий у разных пород крупного рогатого скота,на которые необходимо исследовать сперму от зарубежных и отечественныхбыков-производителей.5. Разработан алгоритм исследования спермы на микоплазмоз, основанныйна поэтапном применении ПЦР-тестирования спермодоз и культивирования положительно прореагировавших половых клеток на усовершенствованных дифференциальных средах для выявления жизнеспособных микоплазм, что позволяет выбраковывать зараженные микоплазмами спермодозы из оборота при искусственном осеменении.
Алгоритм рекомендован ФГБУ ВГНКИ для примененияпри оценке качества спермы.6. Разработана методология проведения микологической экспертизы спермы животных-производителей для индикации и идентификации грибов, размножающихся при низких температурах. Метод утвержден РАН и рекомендованФГБУ ВГНКИ для применения при оценке качества спермы.7.
Разработаны параметры рабочих характеристик современных питательных сред, предназначенных для выявления разных видов микоплазм и грибов сэкспериментально установленными условиями инокуляции и культивирования.Метод утвержден РАН и рекомендован ФГБУ ВГНКИ для применения приоценке качества спермы.8.
Разработан алгоритм оценки качества спермы быков-производителей поморфофункциональным, репродуктивным, генетическим и микробиологическимоказателям. Метод утвержден РАН и рекомендован ФГБУ ВГНКИ для применения при оценке качества спермы.2709. Разработаны молекулярно-генетические методы идентификации мутаций, ассоциированных с наследственными патологиями у крупного рогатогоскота, которые позволили выявить в сперме быков-производителей, поступающей в РФ из-за рубежа, различные генетические аномалии, передающиеся понаследству.
Методы утверждены РАН и рекомендованы ФГБУВГНКИ для применения при оценке качества спермы.10. Разработан комплекс нормативных документов по анализу репродуктивных параметров спермопроб по биологическим, микробиологическим и генетическим показателям, которые явились основой для разработки методическихуказаний и рекомендаций по ветеринарно-санитарному контролю генетическогоматериала, которые были утверждены РАН и рекомендованы ФГБУ ВГНКИ дляприменения при оценке качества спермы.11. Для определения качества генетического материала быков- производителей разработаны, прошли успешную метрологическую экспертизу и валидированы экспертной комиссией отдела обеспечения единства измерений ФГБУ«ВГНКИ», а также утверждены РАН 8 методических указаний и рекомендаций.12. На основании результатов исследований в Межгосударственный стандарт - ГОСТ 26030-2015 «Средства воспроизводства. Сперма быков замороженная.
Технические условия» внесено 18 поправок. В 2017 году вышел новыйГОСТ 26030-2017 «Средства воспроизводства. Сперма замороженная. Технические условия» с внесенными поправками, который вступил в действие.13. Результаты проведенных исследований отражены в учебнике «Методология научного исследования», рекомендованном ФУМО в системе высшего образования.
Авторы учебника награждены золотой медалью ВДНХ на выставке«Золотая осень» (2018) и дипломом Министра сельского хозяйства РоссийскойФедерации.14. Научные данные, полученные в ходе выполнения работы, используютсяв учебном процессе в ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И.Скрябина приизучении студентами и аспирантами дисциплин «Анатомия и гистология и эмбриология животных», «Микробиология и микология», «Генетика сельскохозяй-271ственных животных» и «Акушерство, гинекология и биотехника репродукцииживотных».Рекомендации по использованию научных результатов1. Органам по сертификации генетического материала и ветеринарным лабораториямприисследованииспермодозиспользоватьГОСТ26030-2017«Средства воспроизводства.
Сперма замороженная. Технические условия» свнесенными поправками.2. При оценке морфологических особенностей спермы и обнаружения патологических форм сперматозоидов рекомендуется применять экспресс-методокрашивания сперматозоидов с использованием красителя Farebi.3. Для определения репродуктивных качеств спермы рекомендованно использовать экспресс-тест по определению структуры ДНК-хроматина сперматозоидов.4. При исследовании спермы на микоплазмоз целесообразно применять алгоритм исследования проб с помощью ПЦР-тестирования спермодоз и культивирования положительно прореагировавших образцов на усовершенствованныхдифференциальных средах.5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
