Диссертация (1151292), страница 34
Текст из файла (страница 34)
Метод основанна детекции высвобождающегося пирофосфата при элонгации цепи ДНК в результате синтеза второй цепи ДНК на матрице одноцепочечной ДНК. Пирофосфат высвобождается после встраивания соответствующего нуклеотида во вновьсинтезируемую цепь. В результате ферментативного превращения пирофосфатарегистрируют хемилюминесцентный сигнал.214Определение нуклеотидной последовательности анализируемого генетического локуса с помощью системы генетического анализа PyroMark состоит из 3этапов, представленных на рисунке 54.Рис. 54. Этапы пиросеквенированияПервым этапом анализа явилась наработка ампликона, содержащего полиморфный генетический локус.
Затем проводили пробоподготовку ампликона.ПЦР-продукт инкубировали с частицами сефарозы, покрытыми стрептавидином.При помощи полуавтоматической вакуумно-фильтрацион-ной станции осуществляли щелочную денатурацию ампликона и серию отмывок, в результатекоторых образуется одноцепочечный ПЦР-продукт, который иммобилизируетсяна твердую поверхность (планшет для секвенирования) и используют как матрицу в реакции пиросеквенирующего синтеза. К одноцепочечному биотинилированному ПЦР-продукту добавляли секвенирующий праймер, который отжигается в области анализируемого генетического локуса.Заключительным этапом анализа явилось проведение реакции пиросеквенирующего синтеза и анализ полученных результатов.
Детекцию результатовпиросеквенирующего синтеза проводили автоматически в режиме реального215времени с помощью пиросеквенаторов серии PyroMark, позволяющих в течение10-15 мин секвенировать до 96 образцов одновременно.Особенно удобен метод пиросеквенирование для экспресс-детекции однонуклеотидных полиморфизмов генома, расположенных в областях с известнойнуклеотидной последовательностью.4.1. Идентификация мутаций, обуславливающих наследственныезаболевания крупного рогатого скота голштинской и бурой швицкойпородМетодика выявления мутации в гене SPAST хромосомы 11, ассоциированной со спинальной демиелинизацией (SDM).Спинальнаярецессивноедемиелинизациянейродегенеративное-моногенноелетальноезаболевание,аутосомно-характеризующеесядемиелинизацией и уменьшением количества аксонов в шейном и грудномсегментах спинного мозга.
Обусловлено миссенс-мутацией (однонуклеотид-наязамена) в гене SPAST, расположенного в 11-й хромосоме, кодирующего синтезбелка спастина. Спастин регулирует функции микротрубочек, связанных странспортировкой органелл и нейрофиламетов в аксоны мотонейронов. Врезультате мутации в гене SPAST нарушается аксональный транспорт имиелинизациянервныхволокон.Однонуклеотиднаязаменагуанинавположении 1679 на аденин приводит к замене в составе пептида аргинина наглютамин.Основные клинические признаки проявляются сразу при рождении теленка:отсутствуют попытки подняться, выражена невозможность находиться вположении стоя без поддержки, движения конечностей также отсутствуют.
Вположении лежа на боку развивается легкий или умеренный опистотонус,тремор, спазм мышц тазовых конечностей. Вместе с тем в положении лежа наживоте теленок внешне выглядит практически нормальным. Развивается общаяатрофия мышц, вызванная денервацией. Спинальные рефлексы в норме илинемного усилены. Частота гаплотипа составляет около 2%.216Нами проведен анализ нуклеотидной последовательности гена-мишениSPAST по публичным базам данных (GenBank).Выявлен участок генома, ассоциированный с данным генетическимзаболеванием. Выбраны и синтезированы олигонуклеотидные праймеры,позволяющие амплифицировать фрагмент (размер 97 п.н.) гена SPAST Bos taurusв области мутации.
Праймер SDM.BS-Fb связан на 5’-конце с молекулойбиотина.SDM.BS-Fb5’ – biotin - TCTCAGAATGACCAACGGATACT - 3’SDM.BS-R5’ – TTCAAGCTCTGGAACTCCTACC - 3’Также был синтезирован праймер SDM.BS-seq с последовательностью(5'GCTCTGGAACTCCTACC-3’) для пиросеквенирования целевого фрагмента [ТC/Т GGATAGGACCCAGTGCT] гена SPAST в области мутации.Проведена оптимизация условий ПЦР. Были выбраны следующие условиятермоциклирования «SDM 60°С»:предварительная денатурация 95оС - 5мин (1 цикл);95оС – 10 сек60оС – 10 сек35 циклов72оС – 15 секзаключительная элонгация 72оС - 5мин (1 цикл).Для проверки накопления ПЦР-продукта проводили электрофорез вагарозном геле (рис.
55).217МK-Кв 1/11 2/11Рис. 55. Результаты электрофоретического анализа ПЦР продуктовгена SPAST Bos taurus в области мутации SDM.Образцы 1/11 и 2/11 - ДНК, выделенная из спермы различных животныхв агарозном гелеСбор и анализ данных пиросеквенирования целевого фрагмента гена SPAST[Т C/Т GGATAGGACCCAGTGCT] осуществляли автоматически программнымобеспечением генетического анализатора PyroMark Q96 MD. Результатоманализа явилась расшифрованная последовательность нуклеотидов, приведеннаяпод пиками пирограммы. Высота пиков была пропорциональна количествунуклеотидов, встроившихся в матрицу. С помощью программ анализировалиполученные сигналы, в том числе уровень сигнала по каждому из 4-хнуклеотидов (высота пиков), уровень фонового сигнала, степень достоверностиидентификации нуклеотидов.На рисунке 56 представлены рассчётные пирограммы для каждого извариантов анализируемого полиморфизма.218Нормальныйгенотип(здоровое животное)Гетерозигота(носитель)Гомозигота помутантномуаллелю(больное животное)Рис.
56. Схематичные пирограммы для идентификациимутации «SDM»При идентификации мутации SDM результат интерпретировали наосновании наличия нуклеотидной замены С цитозина на T тимин:1) С/С - нормальный генотип - (гомозигота по нормальному аллелю);2) С/T - присутствуют одна мутантная и одна нормальная копии генов(гетерозигота) – животное – носитель мутации SDM;3) Т/Т - мутантный генотип (гомозигота по мутантному аллелю).Профилиполучаемыхпритестированиирезультатовобразцовпредставлены на рисунке 57.При анализе полученных результатов пирограммы сверяли с расчетнымпрофилем (рис. 57), на основании чего получали заключение о генотипеживотного.219№2№1Рис.
57. Результаты амплификации фрагмента гена SPAST Bos taurusОбразцы № 1 и № 2 - ДНК, выделенная из спермы различных животных.Животные имеют нормальный генотип - гомозигота по нормальному аллелюДля идентификации мутации «SDM» было проанализировано 19 образцовспермы и крови от разных животных. Животных – носителей данной мутациивыявлено не было.Методика выявления мутации в гене KDSR (FVT1) хромосомы 24,ассоциированной со спинальной мышечной атрофией (SMA).Спинальная мышечная атрофия - моногенное летальное аутосомнорецессивное нейродегенеративное заболевание, характеризующееся гибельюмотонейронов в спинном мозге, приводящей к прогрессирующей мышечнойатрофии.
Обусловлено миссенс – мутацией (однонуклеотидная замена) в генеKDSR (FVT1), расположенного в хромосоме 24, кодирующего синтезкетодигидросфингозин-редуктазы, которая катализирует решающую стадиюметаболизма гликосфинголипидов (сфингозина, церамида). В результатемутации С (цитозин) в 490 положении заменяется на Т (тимин), что приводит кзамене аланина в положении 164 на треонин.Состояниебольныхтелят(гомозиготыпомутантномуаллелю)характеризуется тяжелой мышечной атрофией.
В возрасте от 3-х до 4-х недель220наблюдаются симметричная слабость тазовых конечностей, нарушение статолокомоторного акта, затрудненное дыхание, телята лежат с вытянутымигрудными конечностями. Смерть наступает в возрасте от 6 до 8 недельвследствие респираторной недостаточности из-за атрофии дыхательных мышц.По данным литературы, частота встречаемости скрытых носителей составляет от4% до 6%.Проведен анализ нуклеотидной последовательности гена-мишени KDSR попубличнымбазамассоциированныйсданных(GenBank).даннымгенетическимВыявленучастокзаболеванием.генома,Выбраныисинтезированы олигонуклеотидные праймеры, позволяющие амплифицироватьфрагмент (размер 140 п.н.) гена KDSR Bos taurus в области мутации. ПраймерSMA.BS-R1b связан на 5’-конце с молекулой биотина.SMA.BS–F15’ – GTGATCGCCACCATGAAGGAAC - 3’SMA.BS-R1b5’ - biotin – ATCTGCAAAGCCTCCGCAAGTC - 3’Также был синтезирован праймер SMA.
BS-seq1 с последовательностью(5'TCTTCGTGTCTTCCCAG3’) для пиросеквенирования целевого фрагмента[G/A CCGGGCAGCTGGG] гена KDSR в области мутации.Проведена оптимизация условий ПЦР. Были выбраны следующие условиятермоциклирования «SMA 60оС»:предварительная денатурация 95оС – 5 мин (1 цикл);95оС – 10 сек60оС – 10 сек35 циклов72оС – 15 секзаключительная элонгация 72оС – 5 мин (1 цикл).221МК-Кв83/12 96/12Рис. 58.
Результаты электрофоретического анализа ПЦР продуктовгена KDSR Bos taurus в области мутации «SMA»Образцы 83/12 и 96/12 - ДНК, выделенная из спермы различных животныхДля проверки накопления ПЦР-продукта проводили электрофорез вагарозном геле (рис. 58).Сбор и анализ данных пиросеквенирования целевого фрагмента гена KDSR[G/ACCGGGCAGCTGGG]осуществлялиавтоматическипрограммнымобеспечением генетического анализатора PyroMark Q96 MD.
Результатоманализа явилась расшифрованная последовательность нуклеотидов, приведеннаяподпикамипирограммы.Высотапиковпропорциональнаколичествунуклеотидов, встроившихся в матрицу. С помощью программы анализировалиполученные сигналы, оценивали качество прочтения, в том числе уровеньсигнала по каждому из 4-х нуклеотидов (высота пиков), уровень фоновогосигнала, степень достоверности идентификации нуклеотидов.На рисунке 58 представлены расчётные пирограммы для каждого извариантов анализируемого полиморфизма.222Нормальный генотип(здоровое животное)Гетерозигота (носитель)Гомозигота по мутантному аллелю(больное животное)Рис. 59. Схематичные пирограммы для идентификации мутации «SMA»При идентификации мутации SMA результат интерпретировали наосновании замены G гуанина на A аденин:1) G/G - нормальный генотип - (гомозигота по нормальному аллелю);2) G/A - присутствуют одна мутантная и одна нормальная копии генов(гетерозигота) – животное – носитель мутации SMA;3) А/A - мутантный генотип (гомозигота по мутантному аллелю).Профили,полученныепритестированиирезультатовобразцов,представлены на рисунке 59.
При анализе полученных результатов пирограммысверяли с расчетным профилем (рис. 60), на основании чего делали заключениео генотипе животного.223А. Здоровое животное(нормальный генотип)Б. Гетерозигота(носитель)Рис. 60. Реальные пирограммы для идентификации мутации «SMA»Для идентификации мутации «SMA» было проанализировано 19 образцовспермы и крови от разных животных.
Было выявлено 1 животное – носительданной мутации.МетодикавыявлениямутациивгенеSOUXхромосомы5,ассоциированной с арахномиелией и артрогрипозом (SАA).Синдром арахномиелии и артрогрипоза - моногенное летальное аутосомнорецессивноезаболеваниеопорно-двигательногоаппаратасполнойпенетрантностью. Обусловлено инсерцией одной пары нуклеотидов G в генSOUX, расположенный в 5-й хромосоме. Вставка приводит к сдвигу рамкисчитывания и преждевременному образованию стоп-кодона в 124 положении.Мутантный белок состоит из 42-х аминокислотных остатков, (25% от224нормального белка SUOX), что недостаточно для выполнения нормальнойклеточной функции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
