Диссертация (1151292), страница 33
Текст из файла (страница 33)
48, 49).ОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойПоложительныеОтрицательныеРис. 48. Количество проб спермы с положительными отрицательным результатом исследования на плесневые грибыРост грибов наблюдали в 7 образцах из 16, что составило 43,75%.Видовой состав выделенных грибов был следующим:- в 4 образцах обнаружен Aspergillus niger (57,14%);- в 1 образце - Aspergillus flavus (14,29%);- в 3 образцах - грибы семейства Mucoraceae (42,86%).Кроме того, в двух образцах обнаружено 2 вида грибов - Aspergillus niger иMucor spp. (28,57%).205ОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойОсновнойAspergillus nigerAspergillus flavusf. MucoraceaeAspergillus niger+Mucorspp.Рис.
49. Видовой состав грибов, выделенных из спермыРис. 50. Сканоэлектроннограмма А. niger, выделенного из спермыбыка-производителя x20µmИзучение ультраструктурной организации гриба показало наличие у негоскрученной головки, спороносных структур с конидиями, расположенных поверх слоя компактного белого или светло-желтого субстратного мицелия (Рис50).
Гифы мицелия извилистые, плотно контактируют между собой, не имеютчеткой упорядоченности, их верхушки веерообразно расходятся. Подобного ро-206да архитектоника может обеспечивать плотный контакт апикальных структургифов. Установленная микрокартина свидетельствует о фазе роста исследуемогогриба.Рис. 51. Особенности структурной организации A. niger.Сканирующая электронная микроскопия x10µmНа конидиеносце выявлены стеригмы (метулы и фиалиды) зернистой иморщинистой формы. Зачатки метул характеризуются синхронным апикальнымростом и высокой композиционной плотностью. Апикальный рост индуцируетформирование в период кондиогенеза зрелых конидиальных головок (Рис. 51).207Рис. 52.
Ультраструктурная организация A. flavus, выделенногоиз спермы СЭМ-изображение x2 µmКонидиальные головки A. flavus имеют типичную радиальную ориентацию,конидиальные головки наделены, как правило, двухъярусными конидиогеннымиструктурами и метулами, покрывающими всю поверхность вздутия, образующиеих гифоподобные клетки относительно толстостенные (Рис.52, 53).Рис. 53. Структурная организация плесневых грибов рода Penicillium, выделенные из спермы x10µmВ результате изучения криоконсервированной спермы, обсемененной гри-208бами, мы выделили аспергиллы и пенициллы, которые хорошо росли на разныхпитательных средах, были неприхотливы и выживали в условиях глубокой заморозки.При отработке методики микологического исследования спермы мы сделали следующие выводы:- результат микологической экспертизы спермы можно считать отрицательным, если на всех чашках рост грибов не обнаружен, все чашки с контрольнымисредами чистые;- результат считался положительным, если хотя бы на одной из чашек излюбого разведения мы обнаруживали рост грибов, все чашки с контрольнымисредами были чистые;- в случае получения положительного результата исследование проводилиповторно, используя двукратное количество образца спермы и двукратное количество питательных сред;- при повторном положительном результате приступали к идентификациивыделенных грибов и определению уровня их патогенности.Вместе с тем, следует подчеркнуть, что подобного рода исследования следует проводить в специализированной микологической лаборатории.
Так же целесообразно выполнять микологическое исследование технологической цепиполучения спермы (животное-производитель, процессы получения, фасовки ихранения).На основании проведенных исследований разработаны и утверждены вустановленном порядке методические рекомендации «Культуральное микологическое исследование спермы» (№ МЭ 1/0028, от 3 февраля 2017 года).2093.3.
Заключение по разделуВ отношении оценки качества и безопасности спермы быков в России внастоящее время действует ГОСТ 26030, согласно которому определение патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов в спермодозах производятмикробиологическим методом по ГОСТ ISO 8607 и ГОСТ 32198, а методы определения вирусов и микоплазм не регламентированы. Для оценки существующихрисков и, следовательно, необходимости усовершенствования правил контроляспермопродукции актуальным является проведение исследований методом ПЦРдля выявления инфекционных агентов.Полученные нами данные свидетельствует о целесообразности исследоватьспермопродукцию, поступающую от зарубежных предприятий и поставщиковгенетического материала, на следущие микроорганизмы: P.
aueroginosa, E. coli,Mycoplama spp., Mycoplama bovigenetalium, Staphylococcus spp., Streptococcusspp., Ureaplasma diversum, Aspergillus niger, Aspergillus flavus.Считаем необходимым разработку соответствующих НД и проведение инспектирования отечественных и зарубежных предприятий, поставщиков генетического материала на соответствие российским ветеринарным требованиям дляформирования фонда генетических ресурсов, обеспечения конкурентоспособности животноводства и создания альтернативы импорта крупного рогатого скота.Предложенныеалгоритмыисследованияспермопроббыков-производителей на микоплазмоз и кампилобактериоз являются современным методологическим подходом к диагностике данных заболеваний крупного рогатогоскота и имеют важное противоэпизоотическое значение, так как способствуютразработке эффективных мероприятий по профилактике и борьбе с болезнямиживотных, вызываемых кампилобактериями и микоплазменными микроорганизмами.Современный оптимизированный метод идентификации микоплазм в генетическом материале позволит предупредить распространение их путем искусственного осеменения в стадах, а также своевременно выбраковывать спермо-210продукцию и контаминированных быков из племенного ядра, что снизит числоабортов, частых перегулов, яловость и рождение нежизнеспособного молоднякау животных.Совершенствование диагностики микоплазмоза и кампилобактериоза способствует повышению эффективности проведения производственного контроляпродукции в условиях племпредприятий и диагностических исследований в ветеринарных лабораториях при осуществлении ветеринарно-санитарного контроля генетического материала, поступающего как из-за рубежа, так и из российских племцентров.Использование специализированных микологических питательных средпозволит наиболее полно выявить микобиоту, контаминирующую пробу, а также получать достоверные результаты при проведении микологической экспертизы спермы.Среда МПА обеспечивает рост грибов, однако, для культивирования грибовона не предназначена.
При проведении культурального микологического исследования с использованием этой среды исследователь столкнётся, прежде всего, спроблемой «быстрорастущих» грибов. Быстрорастущие грибы – это «плесневые» грибы, обладающие очень высокой скоростью роста: 24-48 часов достаточно для того, чтобы колония такого гриба заняла всю чашку Петри. В этом случаеобнаружение других грибов, скорость роста которых ниже, будет невозможно.
К«быстрорастущим» грибам относятся представители рода Zygomycota (gen.Mucor, gen. Rhizopus и другие). В основном, это сапрофиты, распространённыечрезвычайно широко, поэтому возможность контаминации материала очень высока. Как правило, патогенные и условно-патогенные грибы обладают болеенизкой скоростью роста в сравнении с «быстрорастущими» грибами. Таким образом, результат микологической экспертизы с использованием среды МПА небудет достоверным в случае обнаружения «быстрорастущих» грибов.Для решения этой проблемы нами предложено использование селективныхмикологических питательных сред: PDA, DRBC, картофельно-глюкозный агар.При применении этих питательных сред колонии грибов имеют типичные мор-211фологические признаки, что облегчает их идентификацию.DRBC, среда с дихлораном, бенгальским розовым и хлорамфениколом, является селективной питательной средой для культивирования грибов.
Избирательные свойства среды DRBC обусловлены входящими в её состав дихлораноми бенгальским розовым. Дихлоран – селективный агент, предотвращающийбыстрое развитие «мукоровых грибов» (gen. Mucor, gen. Rhizopus) и ограничивающий их разрастание. Бенгальский розовый – селективный агент, ограничивающий размер колоний и скорость роста «быстрорастущих» грибов, позволяявыявить медленнорастущие виды.Для получения достоверных (истинно положительных или истинно отрицательных) результатов при микологической экспертизе спермы недостаточно использование микробиологических питательных сред, перечисленных в ГОСТ32198-2013 «Средства воспроизводства.
Сперма. Методы микробиологическогоанализа» (мясопептонный агар, МПА), поэтому мы рекомендуем для её осуществления метдику,изложенну выше.212ГЛАВА 4. Разработка молекулярно-генетических методов идентификациимутаций, ассоциированных с наследственными патологиями крупногорогатого скотаНакопление и передача генетических мутаций в последующих накопленияхможет привести к значительным экономическим потерям в АПК России.Входепроведениястандартизированнаяметодиканаучныхдляиспытанийсвоевременногобыларазработанавыявленияскрытыхдефектов и выбраковывания спермопродукции с генетическими аномалиями (соскрытыми дефектами от воспроизводства).Изначально нами был проведен мониторинг наиболее часто встречающихсянаследственных заболеваний в популяции крупного рогатого скота буройшвицкой породы, таких как спинальная демиелинизация, синдром арахномелиииартрогриппоза,прогрессирующаядегенеративнаямиелоэнцефалопатияжвачных, спинальная мышечная атрофия, гаплотип 2 бурой швицкой,остеопороз, дупликация развития, артрогриппоз, гипертрофия мускулатуры,манноцидоз альфа, карликовость.Использовали метод пиросеквенирования, сущность которого заключаетсяв определении нуклеотидной последовательности коротких фрагментов геновразличных мутаций сперматозоидов.Испытание состояло из следующих этапов:1.
Экстракция и очистка ДНК: на данном этапе осуществляли лизис клетокс последующей очисткой ДНК от балластных веществ (белков, полисахаридов идругих соединений).2. Постановка ПЦР с различными парами праймеров, фланкирующимиопределенные участки ДНК в области генов TMEM95 (мутация «BMS»), PLD4(мутация «ZDL»), RASGRP2 (мутация «TP»), MOCS1 (мутация «AS»). На данном этапе осуществляли накопление копий определенной нуклеотидной последовательности генома - целевого участка ДНК.3. Детекция ПЦР-продуктов методом пиросеквенирования.2134. Анализ и интерпретация результатов испытаний.Анализируемые пробы спермы в закрытых пробирках передавали в лабораторию для выделения ДНК.Проводили экстракцию и очистку ДНК, и амплификацию фрагментов генома методом ПЦР. Для идентификации мутаций SDM, SMA, SDA использовали по одной паре праймеров, позволяющих амплифицировать фрагментыгенов TMEM95 (мутация BMS), PLD4 (мутация ZDL), RASGRP2 (мутация TP),MOCS1 (мутация AS) в области мутации, где цепь ДНК служит матрицей дляпиросеквенирования, которая амплифицируется с биотинилированым праймером (Табл.
27).Таблица 27 - Интерпретация результатов электрофоретического анализаПЦР продуктов, положительных и отрицательных контролейКонтрольЭкстракции ДНК, KвНаличие специфических полос, соответствующихфрагментам генов SUOX, SLC4A2, HES4, AGRN,MSTN–ПЦР, К-–ПЦР, К++Примечание: знак «+» означает, что обнаружен ПЦР-продукт,знак «–» – не обнаружен.После завершения реакции ПЦР-продукты подвергали пиросеквенировниюдляопределениянуклеотиднойпоследовательностифрагмен-тов амплифицированной ДНК (определение нуклеотидных последовательностейкоротких фрагментов в области генетических полиморфизмов).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
