Диссертация (1151292), страница 25
Текст из файла (страница 25)
В технологическом процессе применяют специальные красители флюрохромы, обладающие токсическим действием, в основе которого лежит фотосенсибилизирующий эффект. О допустимости такого воздействия с точки зрения нежелательных экономических или генетических последствий в литературе имеются разрозненные и противоречивые сведения.Специальных полномасштабных исследований в последнее время в этомнаправлении не проводили.
Более того, не изучено действие УФ на сперматозоиды крупного рогатого скота, в зависимости от дозы, длины волны, мощности,интенсивности. Кроме того, важной задачей является определение специфичности лазерного воздействия на сперматозоиды, где наряду с изучением биологических параметров спермы, необходимо учитывать высокую спектральнуюплотность энергии лазерного излучения, а также некоторые специальные факторы его когерентности.В качестве критериев оценки воздействия излучения на сперматозоиды приразделении спермы по полу помимо общепринятых в животноводстве критериев(морфофизиологических и цитохимических) мы изучали биохимические и биофизические параметры, в том числе энергетическую функцию митохондрийсперматозоидов, активность ферментов акросомальной части спермотазоидов,устойчивость показателей к снижению рН и т.д.Главным и основополагающим критерием оценки результатов УФлазерного воздействия на спермопробы является изучение результатов осеменения коров облученной спермой.136Однако, исследования на предмет изучения степени оплодотворяемости коров сексированным семенем следует проводить только в случае экономическойнеобходимости.
Если возможно показать негативность воздействия лазерногоизлучения на сперму на уровне предварительного исследования, то необходимость в дальнейших широкомасштабных исследованиях влияния сексированнойспермы на потомство отпадает.2.3. Отработка методики экспресс-окрашивания спермы дляоценки морфологии сперматозоидов при идентификации аномальныхспермиевОбразцы спермы быков-производителей содержат сперматозоиды с различными типами нарушений.
Дефекты в процессе сперматогенеза, некоторые бактериальные инфекции, а также различные формы патологии в репродуктивнойсистеме быков-производителей чаще всего связаны с увеличенным количествоманомальных форм сперматозоидов.Кроме того, в сексированной сперме уровень аномальных сперматозоидовдо настоящего времени не изучен.При идентификации морфологических дефектов нами была выявлена сочетанность их проявления.
Как известно, аномальный сперматозоид обычно имеетсниженный оплодотворяющий потенциал, зависящий от типа аномалии, и можетсодержать также аномальную ДНК (Иолчиев Б.С., 2006). Согласно полученныхнами экспериментальных данных, был подтвержден тот факт, что морфологические дефекты связаны с усиленной фрагментацией ДНК, повышенным рискомструктурных хромосомных аберраций, наличием незрелого хроматина. Именнопоэтому нами проведено исследование по выявлению морфологических особенностей сперматозоидов для оценки формы их головки и жгутика.На рисунках 8 и 9 представлены первичные и вторичные деформации в137строении сперматозоидов.Рис.
8. Классификация первичных деформаций сперматозоидов(руководство ВОЗ, 2010)138Рис. 9. Вторичные деформации сперматозоидовИсходя из классификации ВОЗ, существуют следующие дефекты сперматозоидов: увеличение или уменьшение головки, изменение её формы - грушевидная, круглая, вакуолизированная и локализация вакуолей; изменения шейки:толстая или с неправильным контуром, чрезмерно изогнутая, аномально тонкая;изменения в основной части жгутика - короткая, множественная, сломанная,шпилькообразная, скрученная, с резко выраженным углом; сперматозоид с139большим количеством окрашенной цитоплазмы с неровным контуром, размеромболее одной трети головки, часто с присутствием сочетанного действия другихдефектов.Для объективизации оценки морфологических особенностей сперматозоидов нами был апробирован экспресс-метод их окрашивания с целью выявления аномальных форм с использованием комплекса красителей Farelly Stain,предназначенного для быстрого окрашивания тканей в образце в процессе ихмикроскопического исследования.Характеристика красителя, применяемого в процедуре быстрогоокрашивания для идентификации аномальных сперматозоидов.Общеизвестно, что в кислых красителях (acid stain) необходимый цвет достигают путем действия на вещество кислотного радикала, причем окрашиваются те части исследуемого объекта, которые имеют основную (щелочную)реакцию.
В основных красителях (basic stain) необходимый цвет достигают засчет действия на вещество основного радикала, при этом селективно выявляютте части объекта, которые имеют кислую реакцию. Нейтральные красители(neutral stains) не имеют сродства ни с кислотами, ни со щелочами. Контрастныекрасители (contrast stains) применяют для окрашивания тех участков ткани, которые доступны для выявления первичным красителем.Дифференцированное окрашивание (differential stain) позволяет распознавать присутствующие в ткани структуры, которые после окрашивания можноразличить по цвету при их последующем микроскопировании:В комплект для окрашивания Farelly Stain входят: раствор для фиксации,250 см3, анилиновый синий, 250 см3, кристальный фиолетовый, 250 см3Farelly Stain был разработан для диагностического окрашивания гамет различных видов домашних млекопитающих (включая кроликов и мышей), и домашней птицы.
Окрашивание применяют для морфологической дифференциации нормальных и аномальных форм половых клеток. При дифференцированном окрашивании возможно тинкториально выявлять головку половой клетки,акросому, экваториальную область, среднюю часть и хвост.140Как известно, краситель Farelly не подходит для работы с замороженноразмороженной спермой, содержащей глицерин. Для этой спермы рекомендуютиспользовать краску Spermac. Spermac так же лучше подходит для окрашиванияакросом.Подготовка и фиксацияПредварительно готовили достаточно тонкий мазок. Для высококонцентрированной спермы перед взятием мазка образец разбавляли растворомNaCl (0,9%) или раствором цитрата натрия (3%).
Семенная плазма может искажать полученные результаты.Мазок высушивали на воздухе, избегая его пересушивания.Процедура окрашивания:а) высушенный на воздухе мазок погружали в Fixation Solution на 10 секунд для фиксации.б) затем в краситель анилиновый синий на 20 секунд.в) промывали в проточной воде 5-6 раз; избыток воды удаляли промокательной бумагой, затем мазок погружали на 5 секунд в кристальный фиолетовый, далее его промывали в проточной воде.г) окрашенный мазок высушивали в течении 12 часов в вертикальном положении и изучали в масляной иммерсии.Предложенный ускоренный метод окрашивания при помощи красителяFarelly (Minitube) позволил нам оптимизировать условия идентификации и дифференциации патологических форм сперматозоидов (условия пробоподготовки,время окрашивания, параметры оценки результата) (Табл.9, 10).141Таблица 9 - Результаты морфологической оценки сперматозоидовКол-во быков производителей20Исследовано спермопроб40Патологические формы, %АномальСогну- ЗакрученОтделившаяная голов- тые хво- ные хвося головкакастысты23323633Таблица 10 - Результаты исследований морфологических особенностейсперматозоидов№Быки производителиИсследованоспермопроб1234567891011121314151617181920Sahara BalooNewry BarberShanael Planet BarakaHuijben DG BuickCogent DiegoWiltor CorvetteWilter Cruise VG88Wilter DrummerTW GoodwhoneWoodmarsh MellowWintersell Milo EX92Diepenhoek ModelmanBB MontrealBB Toy Missile EX92Ards ParamountSahara JacobCogent BillCattrona Hotshot EX93Heavenly ParadiseInsider11111111111111111111Патологических форм(морфология) %Количество исследованийIIIIII242223201924243028171918232524312933252227191616192120303132252426303329252927242232212227192120192019212322262428162014Итог%Норма поГОСТдо 18%2321271824312517203125302726242019222616не соотв.не соотв.не соотв.соотв.не соотв.не соотв.не соотв.соотв.не соотв.не соотв.не соотв.не соотв.не соотв.не соотв.не соотв.не соотв.не соотв.не соотв.не соотв.соотв.Установлено, что во всех исследуемых образцах спермы, разделенной пополу, производства Великобритания присутствовали патологические формысперматозоидов.
В 80% этих образцов содержание аномальных форм превышало142нормы по ГОСТ, где указано, что количество сперматозоидов с аномальнымстроением не должно превышать 18%.2.4. Оценка акросомной реакции спермопродукцииСперматозоид – это уникальная высокоспециализированная клетка, основная функция которой заключается в переносе отцовского генома в яйцеклетку (Рис.10). Для выполнения этой функции сперматозоид морфологическиразделен на 2 компонента, необходимых для оплодотворения – головку и жгутик.
Головка, в свою очередь, разделена на акросомальный участок и ядро, содержащее гаплоидный набор хромосом. Акросома образуется в ходе сперматогенеза и может рассматриваться как аналог лизосом.Акросома – это секреторный пузырек, который формируется из пузырьковзоны аппарата Гольджи, начиная с ранних этапов спермиогенеза.Собственно, акросома представляет собой плоскую цистерну, плотно примыкающую к ядру и окруженную мембраной в ней, находится секреторный пузырек.
В нем проходят процессы транспортизации и их химической модификации.Акросомальная реакция – экзоцитоз содержимого акросомы для локальногоразрушения прозрачной оболочки и преодоления сперматозоидом этого барьера.Механизм акросомальной реакции запускается с взаимодействия прозрачной оболочки, окружающей яйцеклетку (Zona Pellucida) с цитолеммой сперматозоида, что приводит к массированному транспорту внутрь головки сперматозоида Са2+ и Na+ в обмен на Н+.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
