Диссертация (1151292), страница 23
Текст из файла (страница 23)
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1. Описание использованных методов исследований, материалов иоборудованияРабота выполнена на базе кафедры микробиологии ФГБОУ ВО МГАВМиБ– МВА имени К.И.Скрябина.Ряд экспериментов по исследованию морфологических характеристик,оплодотворяющейспособностиигенетическогопрофиля,молекулярно-генетические исследования спермы крупного рогатого скотах, поступающей изза рубежа и отечественного производства, были проведены в отделении биотехнологии ФГБУ «ВГНКИ», а также в институте химической физики им. Р.Н.
Семенова РАН и в ведущих племенных центрах РФ - ОАО ГЦВ и ОАО «Московское».Материалы исследований.Материалом для исследований служила спермопродукция быков-производителей - разделенная по полу, свежеполученная неразбавленная, свежеполученная разбавленная синтетическими средами, замороженная сперма от такихпород крупного рогатого скота, как голштинская, бельгийская бело-голубая ибурая швицкая.Всего было исследовано 1352 спермопробы, из них 100 проб сексированнойспермы, 325 проб свежеполученной и 1027 проб криоконсервированной спермы.Из отечественных племобъединений было исследовано 668 проб спермы, завезенной в РФ из-за рубежа – 684 спермодозы.Для культивирования выделенных из спермы бактерий и грибов и определения их биологических свойств использовали следующие основы питательных сред и добавки:- основа бульона для Mycoplasma - основа бульона PPLO BBL; дрожжевойэкстракт Bacto; агар бактериологический Bacto («Becton, Dickinson and Company,США);124- сыворотка крови лошадиная стерильная для культивирования микоплазм(«Биолот», Россия);- галерея API (среды для приготовления суспензий, реактивы для проявления реакций, минеральное масло, тест на каталазу, тест на оксидазу, списокчисловых профилей и программное обеспечение APIWEB).Таблица 8 - Наборы реагентов для ПЦР, использованные в работеN п/п12345НаименованиенабораLSIVetMAX™Campylobacter spp.LSIVetMAX™Campylobacter fetusLSIVetMAX™Mycoplasma bovisТест-система"МИККОМ"Тестсистема«КАМБАК»Формат детекциипродуктовамплиикацииДетектируемый возбудительПроизводительнабораВиды родаCampylobacterГибридизационнофлуоресцентная врежиме РеалLife TechnologiesCorporation(Франция)LSI VetMAX™CampylobacterfetusГибридизационнофлуоресцентная врежиме РеалLife TechnologiesCorporation(Франция)MycoplasmabovisГибридизационнофлуоресцентная врежиме РеалLife TechnologiesCorporation(Франция)Виды рода MycoplasmaЭлектрофоретическая детекция в агарозном гелеAmplisens(Россия)CampylobacterjejuniЭлектрофоретическая детекция в агарозном гелеAmplisens(Россия)При микробиологических, молекулярно-генетических и молекулярнобиологические исследованиях спермы методом ПЦР применяли коммерческиетест-системы и реагенты отечественного и зарубежного производства (Табл.
8).В работе применяли другие реагенты и растворы:-«ПЦР-смесь-2»,содержащаятермостабильную«ДиаТак»ДНК-125полимеразу; смесь дезоксинуклеотидов, 10хдНТФ Mix, содержащая натриевыесоли дезоксинуклеотидов dATP, dCTP, dGTP и dTTP высокой степени очистки(более 98% чистоты), концентрация каждого нуклеотида; набор реагентов дляэкстракции ДНК сорбционным методом - «ДНК-сорб-С»: буфер для лизирующего реагента, раствор для отмывки, сорбент, ТЕ-буфер, ОКО (производства ФГУНЦНИИЭ Роспотребнадзора);- 50хТАЕ (трис-ацетат 2M, ЭДТА 50 мM, pH = 7,6) (Синтол, Россия);- раствор бромистого этидия 10 мг/мл, х.ч.;- маркер молекулярных масс «ДНК GeneRuler 100 bp DNA Ladder ready-touse», Fermentas;- растворы прямых и обратных ПЦР-праймеров с молярной концентрацией10 мМ для электрофоретической детекции; растворы праймеров для пиросеквенирования с молярной концентрацией 0,3 мМ (ФГБУ ВГНКИ, Россия);- раствор 1,4-Дитиотреитол (DTT), 5 г (Thermo Scientific, Хеликон)- агароза ДНК Agarose LE, Axigene (США);- набор лабораторных реагентов для проведения реакции пиросеквенирования PyroMark Gold Q96 Reagents (50x96); стрептавидиновая сефароза Streptavidin Sepharose High Performance; связывающий буфер PyroMark BindingBuffer; денатурирующий раствор PyroMark Denaturation solution; промывочныйбуфер концентрированный PyroMark Wash Buffer 10x; буфер для отжига PyroMark Anneling Buffer (Qiagen, Германия).Оборудование и приборы.Для проведения полимеразной цепной реакции использовали следующееоборудование:- ПЦР-бокс «БАВ-ПЦР-«Ламинар-С» («Ламинарные системы», Россия);- амплификаторы «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) и «GeneAmp PCRSystem 2720» («Applied Biosystems», США);- твердотельный термостат “Термит”, («ДНК-Технология», Россия);- микроцентрифуга Eppendorf» (Германия);- камера для горизонтального электрофореза «SE-2» («Хеликон», Россия);126- весы с точностью измерения не менее 0,1 г («Ohaus Scout SC2020» OHAUSСША);- комплект дозаторов пипеточных с переменным объемом доз одноканальных Digital объемом 0,0005 - 0,01 мл, 0,002 - 0,02 мл, 0,001 - 0,1 мл, 0,1 - 1мл (Thermo Labsystems, РФ);- трансиллюминатор ультрафиолетовый с видеосистемой гель-документирования с цифровой видеокамерой («Infinity 1500/36M Xpress» Vilber Lourmat,Франция);- система генетического анализа Pyro Mark Q96 MD c устройством вакуумной пробоподготовки и программным обеспечением (Qiagen, Германия);- платформенный шейкер Titramax 100 (Heidolph, Германия);- капиллярное дозирующее устройство PyroMark Q96HS Capillary Tip (Qiagen, Германия);- MALDI-TOF масс-спектрометр фирмы BRUCER и др.127а)б)Рис.
5. Конструкция излучателей И-1 и И-2 вариант со стационарной кюветой-эппендорф (а) и с проточной кюветой-капилляром (б).1-штатив; 2- тубус крепления лазера; 3- диодный лазерный модуль; 4- фокусирующая линза лаерного модуля; 5- механизм кремальеры; 6-эппендорф с облучаемым образцом; 7- кюветное отделеие штатива; 8- зеркало контроля лазерного луча; 9- блок питания лазера.Для проведения исследований по действию лазерного УФ-излучения наморфологические показатели и биологические свойства спермы с целью моделирования негативного воздействия на сперму, разделенную по полу, были использованы сконструированные совместно с кандидатом биологических наук,доцентом кафедры радиобиологии и вирусологии ФГБОУ ВО МГАВМиБ-МВАимени К.И.
Скрябина Новиковым В.И. 4 излучателя.В том числе 2 «когерентных» излучателя с длиной волны 405 нм (излучатели далее обозначены как И-1 (5 мВт) и И-2 (10 мВт), а также 2 «некогерентных»,оба с длинами волн 405 и 465 нм, различающиеся по мощности (излучатели далее обозначены как И-3 и И-4 (рис. 5).В «когерентных излучателях» источниками световой энергии служили лазерные модули диодной накачки STLL-405-5 (мощность излучения 5 мВт, длинаволны 405 нм – И-1) и STLL-405-10 (мощность излучения 10 мВт, длина волны405 нм – И-2).
Конструкции обоих лазерных модулей позволяли регулироватьфокусировку луча.В качестве излучателя И-3 (рис. 6) служил осветитель ОИ-28 с галогеннойлампой КГМ-7 (источник сплошного спектра в диапазоне 300 – 1000 нм) и комплектом из двух сменных интерференционных светофильтров (365 нм и 405нм).Питание лампы осуществлялось стабилизированным током 1,5 А от специального источника. Штатив с кюветным отделением в излучателе И-3 был тот же, чтои в излучателях И-1 и И-2.В излучателе И-4 был применен источник линейчатого спектра – ртутнаялампа сверхвысокого давления «ДРТ-120». Для выделения длин волн 405 нм и128365 нм были использованы те же светофильтры, что и в излучателе И-3.Анализ качества спермы после облучения проводили по стандартнымметодикам на автоматических спермоанализаторах «AndroVision» и «Biola-AFS500».
В качестве показателей отслеживали изменение следующих величин: %общей подвижности (ОПД), % прямолинейно поступательной подвижности(ППД),% быстрых клеток, общую (среднюю) скорость движения мкм/с, %неподвижных клеток (НПД).а)б)Рис. 6. Конструкция излучателя И-3 (а) и И-4 (б):1- блок питания; 2- штатив с кремальерой; 3- кожух осветителя ОИ-28; 4 – светоделительная пластина; 5- сменный светофильтр; 6- проточная кювета –капилляр; 7 – кюветодержатель; 8- контрольное зеркало; 9- линза конденсора(кварц); 10- диафрагма; 11- лампа КГМ-7; 12- фокусирующий объектив (кварц).Морфологические исследования выделенных микроорганизмов проводили спомощью электронной модуляционной интерференционной микроскопии насканирующем электронном микроскопе Vega II LMN.129Рис.
7. Схема эксперементаМетоды исследований.При проведении исследований использовали комплексный методическийподход (Рис 7).Применяли общепринятые методы исследования спермы, согласно ГОСТ26030-83 «Сперма быков замороженная», ГОСТ 26030-17 «Средства воспроизводства Сперма быков замороженная», а также морфофункциональные, микробиологические,биологические,биофизические,биохимические,физико-химические, молекулярно-генетические, молекулярно-биологические и статистические методы, предложенные различными авторами, а также разработанныеи усовершенствованные нами в процессе проведения исследований.Отбор проб замороженной спермы и транспортировку в лабораторию проводили по ГОСТ 26030-2015 с учетом требований, предъявляемых для даннойгруппы продукции.Лабораторные пробы хранили в соответствии с условиями, предусмотренными для хранения соответствующей продукции.
Замороженные пробы биологического материала размораживали при температуре от 18°С до 20°С в течение1300,5 ч.Для подготовки анализируемых проб спермы использовали инструменты(ножницы или кусачки), выдержанные в 70 % этиловом спирте и обожженные впламени газовой горелки.Из анализируемых проб выделяли ДНК.Молекулярно-биологический метод включл следующие этапы:1. Экстракция и очистка ДНК: на данном этапе осуществляется лизис клеток с последующей очисткой ДНК от балластных веществ (белков, полисахаридов и других соединений).2.ПЦР с различными парами праймеров, фланкирующими определенныеучастки ДНК, с целью накопления копий определенной нуклеотидной последовательности генома - целевого участка ДНК;3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
