Диссертация (1150042), страница 15
Текст из файла (страница 15)
При соблюдении этих условий в образце происходят минимальные изменения.Единственным выявленным отклонением является уменьшение концентрации свободной69докозагексаеновой кислоты на 19% через 2 недели при -20°С. Увеличение количества циклов з/р приводит к увеличению концентраций СЖК и уменьшению концентраций ЭЖК,причем третий цикл значительно усугубляет изменения.Изменений не выявленоИзменений не выявленоТаблица 21 - Результаты оценки стабильности этерифицированных ЖК в плазме крови приразличных условиях хранения образцов.
Изменения определяемых концентраций СЖК вобразце приведены в % от исходных значений [4]Хранение приХранение при -20 °С в тече- Хранение приХранение при-20 °С, с повтор- ние одной или -70 °С в течеОпределяемые+4 °С без замоным заморажи- двух недель, ние одной илиЖК в пулированраживания,ванием, кол-во без повтор- двухнедель,номобразцекол-во днейцикловного замора- без повторногоплазмы кровиживаниязамораживания12312314 д28 д14 д28 дДодекановая***-36 ****Миристиновая-20 **-41 ****Пальмитолеин-я**+18 +50 ***+24Пальмитиновая+16 *+16 +28 ****Линолевая+24 **+76 **+19+57Олеиновая+23 **+46 ***+24Линоленовая***+22 ****Элаидиновая+19 **+39 *+27+19+41Стеариновая***+17 ****Арахидоновая**+24 +76 *-17-17-60Эйкозапентаенова*+17 +31 +76 *-18*-34яЭйкозатриеновая**+22 +54 ****Эйкозадиеновая-16 **+35 ***+30Докозагексаенова**+26 +52 -19-42-17-37яПримечание: * - Величина изменений не превышает методическую погрешность измерений (≤15%)Хотя хранение образцов при 4 °С в течение двух дней не влияет на концентрацииСЖК, тем не менее ЭЖК нестабильны даже в течение 24 часов в образце при такой температуре.
Интересно отметить, что понижение температуры хранения до -70 °С значительным образом сказалось на концентрациях определяемых соединений.Модельный эксперимент с использованием раствора альбумина с внесением пальмитиновой и олеиновой кислот показал, что альбумин не влияет на концентрацию пальмитиновой кислоты, концентрация же олеиновой при этом уменьшается.
Наглядно этот процесс отражен на рисунке 16. Разницей в связывании кислот с альбумином можно пренебречь, так как константы связывания олеиновой и пальмитиновой приблизительно равны.70Рисунок 16 – Влияние хранения на концентрации пальмитиновой и олеиновой кислот врастворе альбуминаВнесение антиоксиданта в образцы плазмы крови перед хранением не позволилоувеличить продолжительность хранения или количество циклов з/р.Стабильность ЖК в плазме крови при хранении можно оценить методами факторного анализа. Рассмотрим три группы образцов (контроль, "0 циклов", "1 цикл", "2 цикла"и "3 цикла"), как показано на рисунках 17, 18 и 19.
PLS-DA анализ полученного массиваданных позволяет заключить, что первые два цикла з/р значимо не отличаются от исходногообразца.Рисунок 17 – График счетов главных компонент 1 и 2 построенный методом PLS-DA иллюстрирующий сравнение групп образцов "0 циклов", "1 цикл", "2 цикла" и "3 цикла". Результаты получены при определении СЖКЗначимость полученных результатов оценивалась с помощью т.н. перестановочноготеста, реализованного в ПО Multibase 2015 (50 перестановок). Основным влиянием на профиль СЖК обладают насыщенные ЖК с низкой концентрацией миристиновая, додекановая,бегеновая и арахидиновая.
Различия между исходным образцом и образцом, хранившимся2 недели при -20 °С значительно меньше чем между исходным и образцом, хранившимся 4недели при -20 °С. На рисунке 14 представлена аналогичная иллюстрация влияния циклов71з/р на профили ЭЖК. Установлено, что уже второй цикл з/р образцов вносит достоверныеразличия в состав ЭЖК. В таблице 22 суммированы основные результаты, полученные внастоящей работе.Рисунок 18 – График счетов главных компонент 1 и 2 построенный методом PLS-DA иллюстрирующий сравнение групп образцов "0 дней", "2 недели" и "4 недели". Результатыполучены при определении СЖКРисунок 19 – График счетов главных компонент 1 и 2 построенный методом PLS-DA иллюстрирующий сравнение групп образцов "0 циклов", "1 цикл", "2 цикла" и "3 цикла".
Результаты получены при определении ЭЖКОтмечено, что понижение температуры хранения образцов до -70 °С оказывает негативное влияние на вариацию концентраций СЖК и ЭЖК в образцах плазмы крови. Так концентрации СЖК изменяются в диапазоне от -17 до +19 %, а ЭЖК от -62 до +27 % [4]72Таблица 22 – Различные условия хранения аликвот плазмы крови [4]Описание условий храненияЗамораживание пробы до -20 °С, хранение 24 часа и раз- 1 циклмораживание до +20 °С в течение двух часов при комнат2 циклной температуре. Затем следующий цикл.3 цикл1 деньХранение пробы при +4 °С2 дня3 дняЗамораживание пробы до -20 °С, хранение 14 или 28 дней 14 днейи размораживание до +20 °С в течение двух часов при28 днейкомнатной температуреЗамораживание пробы до -70 °С, хранение 14 или 28 дней 14 днейи размораживание до +20 °С в течение четырех часов при28 днейкомнатной температуреДобавление в пробу ди-трет-бутилфенола и заморажива- 1 циклние пробы до -20 °С, хранение 24 часа и размораживание2 циклдо +20 °С в течение двух часов при комнатной темпера3 циклтуре.
Затем следующий циклРазбавление пробы метанолом (1 к 2), охлаждение -20 °С, 14 днейхранение 14 или 28 дней и нагрев до +20 °С в течение двух28 днейчасов при комнатной температуреРезультатОтсутствуютизменениявсоставеСЖК↑, ЭЖК↓СЖК↑↑, ЭЖК↓↓ЭЖК↓, СЖК стабильны в течениедвух днейСвободная ДГЕ↓Значимые изменения в составеЭЖК и СЖКДобавление антиоксиданта не повлияло на результатыЗначительные изменения в составеЭЖК и СЖКВ результате предложены рекомендации по надлежащему хранению образцовплазмы крови для определения ЖК [4]. Образцы сохраняют пригодность для анализа в течение одного цикла замораживания/размораживания, до 14 дней хранения при -20 °С.
Показано, что СЖК проявляют большую стабильность, их определение возможно и после двухциклов замораживания/размораживания, даже после хранения образцов при +4 °С в течениедвух дней. Показано, что использование добавок антиоксиданта в плазму крови перед хранением не позволяет увеличить продолжительность хранения или количество циклов замораживания/размораживания. Понижение температуры образцов до -70 °С изменяет первоначальный состав СЖК и ЭЖК.3.6 Изменения профилей жирных кислот плазмы крови крыс при введениисублетальных количеств зарина, зомана и вещества типа Vx, с применением антидотнойтерапииРазработанный метод был применен для оценки влияния ФОС на состав СЖК и ЭЖКплазмы крови [128]. Методом PLS-DA на рисунке 20 проиллюстрированы различия в профилях свободных ЖК плазмы крови при введении ½ LD50 зарина, зомана, RVX и терапев73тической дозы Пеликсима.
Можно заметить, что воздействие RVX через 3 часа заметно отличается и от контрольной группы и от групп, которым вводили другие ФОС или Пеликсим.RVXSarin1.160PELIKSIMSoman-2.77PC2 (20.1% )Control2.557-2.05PC1 (49.4% )Рисунок 20 – График счетов старших главных компонент, иллюстрирующий различия вконтрольной группе животных и группах ½ LD50 зарина, зомана, RVX и Пеликсим. Результаты обработаны методом PLS-DAВведение крысам ½ LD50 зарина или зомана вызывает уменьшение уровня СЖК через 3 часа на 42% и на 34% соответственно (p < 0,05, как показано на рисунках 21а и 21б).Через 24 часа уровень СЖК возвращается к норме. Все результаты измерений суммированыв таблице 21.Рисунок 21а и 21б – Изменение суммарного содержания СЖК при введении ½ LD50 зарина и зомана крысам (1 серия)74Известно [204], что зоман вызывает судороги, которые сопровождаются повышенным катаболизмом фосфолипидов в мозгу крыс с образованием холина и свободных ЖК.Судороги, вызванные иными причинами, например, обратимым ингибитором холинэстеразы неостигмином [148], который не способен фосфорилировать ферменты, также приводят к увеличению уровней СЖК (особенно арахидоновой кислоты) и диацилглицеридов вмозгу, так как происходит активация фосфолипазы А2 [205], причем введение антиконвульсантов после отравления зоманом предотвращает увеличение СЖК в мозгу, но не предотвращает ингибирование AChE.
Однако увеличение концентрации СЖК в мозгу не связанос концентрациями СЖК в плазме крови, поэтому остается неясной причина уменьшенияконцентраций СЖК в первые часы после отравления. С другой стороны, ФОС подавляютдействие внеклеточных липаз и внутриклеточной холестерин-эстеразы, что должно приводить именно к уменьшению концентраций СЖК, однако не зафиксировано увеличенияуровня ТГ - одних из возможных субстратов липаз [137]. Антидотная тепапия и купирование судорог [206] с помощью препарата «Пеликсим» (реактиватор холинэстеразы и атропин) не оказывает влияния на профиль изменения концентраций СЖК после отравленияФОС, что наглядно продемонстрировано на рисунках 22а и 22б: можно наблюдать снижение уровня СЖК через 3 часа и восстановление через 24 часа.Рисунок 22а и 22б - Изменение суммарного содержания СЖК при введении ½LD50 зарина (слева) и зомана (справа) и антидотной терапией Пеликсимом75400,0306,5Конц-ия СЖК, мкг/мл350,0300,0263.9211.3*250,0200,0150,0100,050,0Контроль3 часа24 часаРисунок 22 – Изменение суммарного содержания СЖК при введении терапевтической дозы ПеликсимаМожно заключить, что механизм, ответственный за уменьшение уровня СЖК послеотравления, не связан с судорогами и не связан с ингибированием липаз, так как оксимы,входящие в состав антидотов, представляют собой достаточно реакционноспособные нуклеофильные агенты, способные разрывать различные связи ФОС-фермент для реактивацииферментов [207].
В пользу этого довода говорит и тот факт, что введение Пеликсима крысам без ФОС оказывает аналогичное влияние на уровни СЖК, как пказано на рисунке 24.Рисунок 24а и 24б – Изменение суммарного содержания СЖК при введении ½LD50 RVX (n=3) и 2×0,4 LD50 RVX (n=6)RVX оказывает иное действие на уровень СЖК в плазме крови в первые часы послеотравления. Введение RVX в дозе ½ LD50, как показано на рисунке 24а, вообще не вызывает изменений в концентрации СЖК в течение суток после отравления, в то время, каквведение 2×0,4 LD50 RVX вызывает их значимое увеличение на 35% через 3 часа, чтонаглядно представлено на рисунке 24б. Введение Пеликсима после RVX также приводит кснижению и последующему восстановлению СЖК, что продемонстрировано на рисунке7624а.
Введение Карбоксима (не содержит атропин) после получения 2×0,4 LD50 RVX не оказывает влияния на профиль СЖК в течение 24 часов (происходит увеличение и последующий спад, как показано на рисунке 25б). Можно заключить, что реактивация ферментов неизменяет профиль СЖК в первые сутки после отравления ФОС, следовательно, такие изменения не связаны напрямую с фосфорилированием ферментов.Введение 2×0,4 LD50 RVX можно охарактеризовать и более отставленными последствиями, как показано на рисунке 27а. Через 24 часа после отравления происходит временный спад концентрации СЖК практически до исходного уровня, а затем постепенный рост,который через 7 дней превышает норму на 81%. При таком увеличении концентрации, СЖКмогут проявлять т.н. липотоксичность, так как увеличение доступности СЖК приводит кингибированию окисления глюкозы и ее захвата мышечными клетками крыс [208].
Повышенная концентрация СЖК в плазме приводит к нарушениям сигнального каскада инсулина [209]. В течение короткого времени экспонирования СЖК (несколько часов) глюкозазависимая секреция инсулина увеличивается, тогда как при хроническом воздействии СЖКсекреция инсулина затрудняется [210]. На молекулярном уровне избыточная аккумуляциявнутримышечных метаболитов СЖК, таких как Ацил-КоА, церамид и диацилглицериды,может приводить к избыточной активации различных ферментных систем [211].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
