Диссертация (1150042), страница 14
Текст из файла (страница 14)
0 01 6 . 0 01 8 . 0 02 0 . 0 02 2 . 0 02 4 . 0 02 6 . 0 02 8 . 0 03 0 . 0 0T im e - - >Рисунок 15 - Масс-хроматограммы ЖК по характеристичным ионам полученные послеэкстрактивного алкилирования СЖК (вверху) и переэтерификации ЭЖК (внизу) изплазмы кровиВ таблице 17 приведены метрологические параметры методики измерений СЖК иЭЖК, такие, как показатель повторяемости (среднего квадратического отклонения повторяемости) - σr(Δ), % отн.; показатель воспроизводимости (среднеквадратического отклонения воспроизводимости) - σR(Δ), % отн.; показатель точности (Р = 0,95) - ± Δ, % отн.; показатель правильности (границы, в которых находится неисключенная систематическая погрешность методики).Оценку воспроизводимости метода осуществляли следующим образом: плазмукрови, полученную от нескольких добровольцев, объединяли, тщательно перемешивали иделили на 15 частей.
В каждой аликвоте определяли СЖК и ЭЖК. Результаты приведены втаблице 17. Относительная ошибка определения большинства ЖК менее 15 %. Исключениесоставляют ЖК, фоновое содержание которых ниже или на уровне предела определения.64Таблица 17 – Метрологические параметры методики измерений СЖК и ЭЖК в плазмекровиСЖКЭЖКЖКσr(Δ),σR(Δ),±Δ, %σr(Δ),σR(Δ),±Δ, %% отн.
% отн. отн.С*, мкг/мл% отн. % отн. отн.С, мкг/млС11:057140,02-0,16-**С12:06480,13-8,201415290,9-3,7С13:02820390,04-0,100,08-0,12С14:11821420,26-1,522614270,3-0,9С14:01513251,6-16,175101,4-6,1С15:12617330,03-0,19С15:01612230,52-2,631510200,3-0,9С16:15594-361120,9-10,4С16:022458-19612420-76С17:12212240,5-2,01612230,3-0,7С17:01716311,0-2,5106130,2-0,6C18:3n6 3725480,5-8,0129180,3-1,8C18:2n6c 237127-42612434-103C18:1n9c 34762 - 23012417-70C18:3n3 1911220,8-6,51310200,5-1,7C18:1n9t 107135,5-25,068150,9-7,1C18:054728-7921210-26C20:4n6 361284-20511211-54C20:51714271,9-27,01414270,4-5,9C20:3n8 1310208-253231,0-4,9C20:289171,5-4,8126110,4-1,2C20:13221400,7-2,1129170,3-0,7C20:3n10,7-2,11341938C20:02723430,1-0,52924460,1-0,2C21:01914270,03-0,05C22:675911-563242,3-31,9C22:23324470,00-0,34C22:1n9 3120400,18-0,33C23:064541060,00-0,244230590,00-0,27C24:01817320,20-0,59Примечание: * - диапазон концентраций ЖК в плазме крови; ** - ЖК отсутствует в плазме крови в этерифицированной форме.65Таблица 18 – Сравнение содержания концентраций СЖК после экстрактивного алкилированияСредние значеСредние исходныеИзменениения конц-ийСЖКзначения конц-ийконц-ийСЖК после изСЖКСЖК, %влечения ЭЖКУндециловая кислота0,170,14- 14Лауриновая кислота2,52,92+11Тридекановая кислота0,180,15-13Миристолеиновая0,380,43+9Миристиновая кислота2,062,34+10Пентадекановая кислота0,580,53-6Пальмитолеиновая кислота2,813,19+8Пальмитиновая кислота43,3948,15+7цис-10-Гептадеценоат0,270,31+9Маргариновая кислота0,410,37-7Гамма-линоленат0,440,51+10Линолевая кислота6368,16+5Олеиновая кислота21,0725,4+13Линоленовая кислота0,730,84+10Элаидиновая кислота1,241,17-4Стеариновая кислота18,6417,96-3Арахидоновая кислота35,4631,99-7цис-5,8,11,14,171,461,73+12эйкозапентаеновая кислотацис-8,11,14-Эйкозатриеновая2,462,42-1цис-11,14-эйкозадиеновая0,590,68+10кислотаГондоиновая(цис-110,360,42+11эйкозеновая кислота)Арахиновая кислота0,180,15-13Генэйкозановая кислота0,040,05+15цис-4,7,10,13,16,1911,3612,85+9докозагексаеновая кислотацис-13,16-докозеновая кислота0,330,330Эруковая кислота0,280,31+7Бегеновая кислота0,070,08+9Трикозановая кислота0,260,260Лигноцериновая кислота0,560,560Апробация метода.Разработанную методику использовали для определения эндогенного содержанияЭЖК и СЖК в плазме крови доноров.
Группа добровольцев насчитывала 30 практическиздоровых мужчин 20-25 лет. Отбор крови проводили утром натощак из кубитальной веныв пробирки для гематологии Vacuette с ЭДТА в качестве антикоагулянта. Результаты определения ЭЖК и СЖК в плазме крови добровольцев представлены в таблице 19.66Таблица 19 - Экспериментально измеренные концентрации ЭЖК и СЖК в плазме кровидоноровС11:0Концентрации ЭЖК, мкг/мл*Орлова Т.И.Лит.0,03 (0,00;0,09)-С12:01,26 (0,13; 8,20)31,1 ± 12 [199]1,15 ± 0,18 [198]3,94 ± 0,17 [200]С13:0С14:10,06 (0,04; 0,10)0,67 (0,26; 1,52)-С14:06,27 (1,60; 16,08)135,2 ± 35 [211]17,2 ± 4,2 [198]21,90 ± 1,42 [209]С15:1С15:00,14 (0,03; 0,19)1,25 (0,52; 2,63)4,64 ± 0,28 [208]С16:17,53 (3,58; 35,68)96,8 ± 27 [209]23,90 ± 4,09 [198]19,74 ± 2,81 [208]ЖКС16:0135,48 (58,37; 195,62)С17:1С17:0C18:3n60,97 (0,49; 1,99)1,48 (0,98; 2,55)2,01 (0,46; 8,15)269,95 (126,95;425,80)C18:2n6cC18:1n9c128,80 (61,85; 226,23)C18:3n3C18:1n9t2,99 (0,79; 6,53)11,15 (5,46; 24,99)367 ± 125 [198]404,00 ± 51,60[199]769,20 ± 68,43[200]23,4 ± 11 [209]69,1 ± 26 [209]535,6 ± 218 [209]737,00 ± 117,00[199]634,38 ± 26,30[200]58,9 ± 24 [209]Концентрации СЖК, мкг/мл*Орлова Т.И.Лит.0,14 (0,09; 0,18)0,2 – 2,4 [197]13,65 ± 7 [198]1,90 (0,91; 3,66)1,45 ± 0,25 [199]0,95 ± 0,11 [200]0,10 (0,08; 0,12)0,53 (0,28; 0,94)< 0,08 [197]1,8-15,9 [201]0,7-5,0 [197]2,87 (1,44; 6,09)52,7 ± 14 [198]9,37 ± 2,50 [199]3,73 ± 0,32 [200]0,52 (0,30; 0,89)2,31 ± 0,29 [200]1,1-21,6 [201]2,12 (0,91; 10,43)0,5-4,8 [197]42,25 ± 17 [198]13,74 ± 3,21 [199]19,2-199,6 [201]14,8-56,6 [197]40,93 (20,09; 75,85)163,5 ± 78 [198]256,00 ± 46,20 [199]130,37 ± 3,77 [200]0,37 (0,28; 0,72)9 ± 4 [198]0,36 (0,15; 0,62)32,5 ± 14 [198]0,44 (0,25; 1,81)14,91 ± 6,0 [202]11,6-102,8 [201]57,33 (34,32; 103,09)3,6-46,4 [197]30,71 (16,95; 70,20)1,04 (0,51; 1,72)2,25 (0,88; 7,14)51,08 (28,38; 78,50)310,2 ± 168 [209]123,00 ± 14,10[199]254,70 ± 9,60 [200]132,49 (84,42; 205,00)287,5 ± 94 [209]120,00 ± 17,40[199]174,78 ± 12,19[200]C20:58,74 (1,84; 26,81)66,4 ± 39 [209]11,10 ± 1,96 [199]1,49 (0,44; 5,85)C20:3n814,42 (7,60; 24,54)61 ± 28 [209]28,80 ± 3,36 [199]28,18 ± 1,71 [199]1,92 (1,00; 4,86)C20:22,41 (1,54; 4,77)89,4 ± 22 [210]0,64 (0,42; 1,19)C20:11,38 (0,72; 2,07)10,3 ± 7 [209]0,43 (0,30; 0,71)C18:0C20:4n66716,74 (9,89; 26,23)25,23 (11,28; 53,89)10,4-74,4 [197]226 ± 98 [198]479,00 ± 90,00 [199]81,41 ± 4,54 [200]13,83 ± 1,9 [202]16,05 ± 9 [198]8,8-133,5 [201]4,8-21,3 [197]144 ± 55 [198]77,80 ± 12,40 [199]47,74 ± 4,01 [200]172,53 ± 2,3 [202]165,1 ± 73 [198]92,70 ± 16,80 [199]16,24 ± 2,26 [200]18,41 ± 9,5 [202]21,35 ± 15 [198]10,50 ± 2,40 [203]1,27 ± 0,17 [200]47,86 ± 2,4 [202]27,05 ± 15 [198]23,70 ± 3,55 [203]6,01 ± 4,4 [202]34,5 ± 16 [198]7,31 ± 3,5 [202]0,4 ± 0,2 [198]Концентрации СЖК, мкг/мл*Орлова Т.И.Лит.C20:3n127,05 ± 15 [198]0,35 (0,34; 0,36)14,27 ± 0,24 [199]10,39 ± 3,4 [202]31,1 ± 18 [209]8,95 ± 4 [198]C20:00,24 (0,14; 0,46)3,23 ± 0,27 [199]0,12 (0,09; 0,20)3,81 ± 0,15 [199]4,29 ± 0,52 [200]1,36 ± 0,15 [200]C21:00,04 (0,03; 0,05)0,05 (0,04; 0,08)43,78 ± 2,8 [202] 57,4 ±120,3 ± 57 [209]21 [198]C22:629,93 (10,99; 56,23)15,80 ± 5,74 [199]6,47 (2,34; 31,86)30,26 ± 7,19 [203]19,28 ± 2,41 [200]3,77 ± 0,12 [200]C22:2- (-; 0,34)**40,1 ± 27 [209]14,65 ± 5 [198]C22:1n90,30 (0,18; 0,33)0,32 (0,28; 0,34)21,54 ± 2,9 [202]С22:00,07 (0,05; 0,10)156,4 ± 66 [209]0,07 (0,05; 0,10)67,4 ± 25 [198]C23:00,14 (0,00; 0,24)C24:10,29 (0,01; 0,30)31,16 ± 3,5 [202]17,53 ± 4,4 [202]C24:00,55 (0,20; 0,59)0,56 (0,54; 0,62)6,05 ± 0,51 [200]1,26 ± 0,15 [200]Примечание: *- концентрации представлены в виде: медиана (персентиль 5 %; персентиль 95 %); ** - ЖКобнаружена в плазме крови только у двух доноров, что связано с нутритивными особенностями.ЖККонцентрации ЭЖК, мкг/мл*Орлова Т.И.Лит.61 ± 28 [209]0,43 (0,04; 0,51)4,93 ± 0,43 [199]Имеющиеся в литературе многочисленные данные о содержании СЖК и ЭЖК вплазме крови человека крайне противоречивы и часто сообщаются без указания пола, возраста, спектра заболеваний.
Результаты исследований, представленные в таблице 17, вдальнейшем планируется использовать в рамках фармакометаболомных исследований спривлечением того же контингента добровольцев.Таким образом, в рамках настоящей работы разработана двухстадийная процедураколичественного определения ЭЖК и СЖК в плазме крови с использованием газовой хроматомасс-спектрометрии.
Диапазон измеряемых концентраций 0,2-800 мкг/мл. Относительная ошибка определения большинства аналитов не превышает 15 %. При переходе отпервой стадии переэтерификации ЭЖК в метиловые эфиры и экстракции их из матрицы, ковторой - экстрактивному метилированию СЖК, - предложено проводить коррекцию рНпробы путем разбавления фосфатным буфером (рН 8).
Разработанная процедура позволяетпроводить количественное определение ЖК в плазме крови на уровне биологически обусловленных концентраций. Показано отсутствие конверсии ЭЖК в СЖК в ходе процедуры3.5 Оптимизация условий хранения образцов плазмы крови для определения жирныхкислот методом газовой хроматомасс-спектрометрииСледует отметить, что многие приведенные в литературе данные по влиянию хранения биологических образцов на определение ЖК противоречивы и получены разными ме68тодами, что вынуждает провести собственное исследование.
Одной из задач работы являлось установление влияния условий хранения биологических образцов на результаты хроматомасс-спектрометрического определения свободных и этерифицированных ЖК вплазме крови [4].Для каждого аналита вычисляли матричный фактор, равный отношению площадипика аналита в присутствии матрицы к площади пика в отсутствии матрицы (водного раствора аналита). Установили, что коэффициенты вариации IS-нормализованного матричногофактора не превышают 15%. Матричный фактор составляет от 0,6 до 0,9 для различныхкислот (в среднем 0,72 ± 0,08), при этом его зависимости от числа атомов углерода в молекуле жирной кислоты не выявлено.В таблицах 20 и 21 приведены результаты оценки стабильности этерифицированныхи свободных ЖК в плазме крови при различных условиях хранения образцов.Изменений не выявленоИзменений не выявленоТаблица 20 - Результаты оценки стабильности этерифицированных ЖК в плазме крови приразличных условиях хранения образцов.
Изменения определяемых концентраций ЭЖК вобразце приведены в % от исходных значений [4]Хранение при Хранение при-20 °С в течеОпределяемые ЖК+4 °С без замо- -20 °С, с повт.-70 °С в течение одной иливпулированномраживания, кол- Зам-ем, кол-воние одной илидвух недельобразцеплазмыво днейцикловдвух неделькрови12312314 д 28 д14 д 28 дДодекановая-21 *-38-53 -76-30-62-64Миристиновая-21 *-29*-33**-16Пальмитолеин-я-30 -26-27-19 -27+20*+38Пальмитиновая-28 -28-32*-22**+21Линолевая-31 -32-23+22 +56+55*+91Олеиновая-23 -22-15*+34+36*+47Линоленовая-17 -37-31-42 -27+31+27+60Элаидиновая*-29-25*-16**+43Стеариновая-22 -26-21-20 -26**+20Арахидоновая-18 -16-21*-18**+16Эйкозапентаеновая *****+20*+54Эйкозатриеновая-17 -19**+22***Эйкозадиеновая***-20 -24-18-17-18Докозагексаеновая *+18 +27*-46-68-32-66Примечание: * - Величина изменений не превышает методическую погрешность измерений (≤15%)В результате можно рекомендовать следующие надлежащие условия хранения: температура -20 °С, продолжительность не более двух недель и не более одного замораживанияобразцов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
