Диссертация (1150042), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Важно отметить, что при выпаривании досуха, короткоцепочечные кислотыС6-С10 испаряются, и их невозможно определить далее. Поэтому, для определения полногопрофиля ЖК, необходимо выпаривать до конечного объёма примерно 50 мкл. Конечныйобъём доводили до 100 мкл гексаном. В итоге проба была сконцентрирована в 5 раз. Масс57хроматограммы стандатной смеси метиловых эфиров ЖК реконструированные по характеристичным ионам и образца мочи посли экстрактивного алкилирования представлены нарисунке 13.A b und a nc eT IC : K a rm a n o vмочи_ 1 5 .D \ d a ta .m sОбразец200000150000100000500001 0 .0 01 2 .0 01 4 .0 01 6 .0 01 8 .0 02 0 .0 02 2 .0 02 4 .0 02 6 .0 02 8 .0 03 0 .0 03 2 .0 03 4 .0 0T im e -->A b und a nc eСтандартнаяTсмесьметиловых эфиров ЖКIC : C a l_ 4 0 0 .D \ d a ta .m s (*)200000150000100000500001 0 .0 01 2 .0 01 4 .0 01 6 .0 01 8 .0 02 0 .0 02 2 .0 02 4 .0 02 6 .0 02 8 .0 03 0 .0 03 2 .0 03 4 .0 0T im e -->Рисунок 13 - Масс-хроматограммы реконструированные по характеристичным ионамсмеси метиловых эфиров ЖК и образца мочи посли экстрактивного алкилирования.3.3 Построение градуировочных зависимостейГрадуировочные зависимости строили по стандартным растворам ЖК после экстрактивного алкилирования из метанола.
Были проанализированы градуировочные растворы с концентрацией каждой кислоты 0,02, 0,2, 2, 4, 8, 20, 50 мкг/мл. После оценки эндогенных уровней ЖК в матрице, для кислот с низкими значениями концентраций, на градуировочных графиках были изменены верхние пределы количественного определения (до 20мкг/мл).Для корректного построения градуировочных кривых ввели весовой коэффициент.Исходя из индивидуальных свойств кислот и ранга определяемых концентраций, весовойкоэффициент высчитывали для каждой кислоты отдельно, по минимальной сумме относительных ошибок. Вид градуировочных графиков и хроматографических пиков, определяемых ЖК приведен в приложении А.58Таблица 15 – Воспроизводимость методики определения СЖК в плазме крови и мочеОтносительнаяОтносительнаяМетиловый эфирошибка определения ошибка определенияжирной кислотыСЖК в плазме, %СЖК в моче, %*Капроновая, С6:0149Гептановая (энантовая), C7:0157Каприловая, C8:0108Нонановая (пеларгоновая), C9:01511Каприновая, C10:0146Ундециловая, C11:01813Лауриновая, C12:01610Тридекановая, C13:01716Миристиновая, C14:01114Миристолеиновая, C14:11512цис-10-Пентадеценовая, C15:1157Пентадекановая, C15:0129Пальмитолеиновая, C16:1n-71316Пальмитиновая, C16:0811цис-10-Гептадеценовая, C17:11014Маргариновая, C17:0128γ-Линоленовая, C18:3n61210Линолевая, C18:2n6c1112Олеиновая, C18:1n9c1213Линоленовая, C18:3n31110Линоэлаидиновая, C18:2t1416Элаидиновая, C18:1n9t1113Стеариновая, C18:0914Арахидоновая, C20:4n6117цис-5,8,11,14,17-Эйкозапентаеновая, C20:5139Нонадекановая, C19:01313цис-8,11,14-Эйкозатриеновая, C20:3n81410цис-11,14-Эйкозадиеновая, C20:21511цис-11-эйкозеновая, C20:1168цис-11,14,17-Эйкозатриеновая, C20:3n111610Арахиновая, C20:01714Генэйкозановая, C21:01715цис-13,16-Докозеновая, C22:21816Эруковая, C22:1n91711цис-4,7,10,13,16,19-Докозагексаеновая,149C22:6n3Бегеновая, C22:01814Трикозановая, C23:01713Нервоновая, C24:1n9198Лигноцериновая, C24:017959Так как невозможно построить градуировочные графики с использованием образцовс внесением аналитов, наиболее рациональным представляется использование метода относительной градуировки для количественного определения СЖК в биожидкостях [2].
Коэффициент извлечения/превращения К вычисляли по формуле:KSi m Si100,% ,S stгде K – коэффициент извлечения, %; Si – площадь хроматографических пиков в образцеплазмы без добавки; Si+m − площадь хроматографических пиков аналитов в образце плазмыс добавкой стандартной смеси ЖК; Sst − площадь хроматографических пиков аналитов встандартной смеси ЖК.Коэффициенты корреляции градуировочных графиков составляют не менее 0,990,минимальные значения характерны для цис-10-пентадеценовой и элаидиновой кислот:0,9906 и 0,9902 соответственно.Воспроизводимость количественного определения СЖК оценивали следующим образом: в объединенный образец плазмы крови от нескольких добровольцев вносили добавку стандартной смеси ЖК.
Стандартную добавку вводили для оценки воспроизводимости кислот, находящихся в плазме крови человека в минорных количествах. Затем образецразделяли на 15 аликвот, в которых определяли СЖК. Результаты представлены в таблице15.В табл. 16 приведены результаты определения концентраций СЖК в плазме крови имоче добровольцев, а также плазме крови крыс.60Таблица 16 - Экспериментально определенные концентрации СЖК в плазме крови людей икрыс и в моче человека [2]Содержание СЖК в Содержание СЖК вСодержание СЖК в моче чеплазме крови чело- плазме крови крыс,ловека, мкг/ммоль креатининаСЖКвека, мкг/млмкг/млminmaxminmaxminmaxC6:00,02*0,600,410,55-***C8:00,070,290,091,042,4024,80C10:00,160,720,160,710,0012,80C11:00,050,150,040,14C12:00,212,950,171,43C13:00,020,120,160,24**C14:10,304,270,00286,00C14:00,9610,772,484,650,4012,20C15:10,260,890,508,90C15:00,1510,400,600,780,007,40C16:1n-70,2323,673,336,25C16:030,53163,5729,3542,550,00556,70C17:10,047,610,0041,70C17:00,321,250,160,670,005,60C18:3n60,330,720,260,39C18:2n6c 21,96162,9340,5474,420,0036,60C18:1n9c 9,27179,4410,6223,330,001161,30C18:2t0,081,26C18:3n30,372,843,357,38C18:1n9t0,9211,271,392,920,0028,40C18:08,4038,296,6918,4911,70583,20C20:4n61,693,808,7618,970,008,50C20:50,222,130,691,720,0011,50C20:3n80,291,000,290,940,705,20C20:20,311,080,020,800,0026,40C20:10,321,300,020,360,004,90C20:3n11 0,170,310,003,10C20:00,080,370,020,630,006,40C21:00,010,140,605,20C22:6n30,975,221,013,500,7016,50C22:20,060,33C22:1n90,060,180,005,30C22:00,010,280,020,351,4011,20C23:00,116,281,006,50C24:1n90,153,040,020,530,0044,20C24:00,080,700,020,171,7015,40Примечание: * – минимальное зарегистрированное значение концентрации ниже предела определения; ** –целевое соединение определяется в плазме крови только людей; *** – целевое соединение не определяется вмоче.613.4 Определение свободных и этерифицированных жирных кислот в плазме кровиметодом газовой хроматоматографии с масс-селективным детектированиемМетод экстрактивного алкилирования был успешно применён для определения свободных ЖК в плазме крови.
Однако для проведения более детального исследования оказалось необходимым совместное определение СЖК и ЭЖК в одной пробе.Одной из задач работы являлась разработка способа подготовки образцов к ГХ-МСанализу, позволяющего проводить селективное определение СЖК и ЭЖК в одной аликвотеобразца в “мягких” условиях. Разработанная процедура основана на сочетании “классической” переэтерификации раствором KOH в MeOH и предложенного нами ранее методаопределения СЖК с использованием экстрактивного алкилирования [3]. Разработанный метод характеризуется небольшой продолжительностью реакции, “мягкими” условиями и высокими выходами продуктов реакции.
Объединение стадий экстракции и получения летучих производных позволяет работать с различными биологическими жидкостями без дополнительных стадий депротеинизации и фильтрации. Наглядно схема последовательногоопределения СЖК и ЭЖК в плазме крови представлена на рисунке 14.Рисунок 14 - Схема последовательного определения СЖК и ЭЖК в образце плазмы кровиИз рисунка 10 видно, что на первой стадии пробоподготовки необходимо извлечьЭЖК из матрицы пробы. Для этого применяли процедуру переэтерификации связанных ЖКв их метиловые эфиры с помощью 0,4 М раствора гидроксида натрия в метаноле с последующей экстракцией гексаном. Условия протекания реакции можно охарактеризовать какмягкие, однако требовало подтверждения отсутствие гидролиза ЭЖК, что могло бы приво-62дить к завышенным результатам определения СЖК.
Для этого образец плазмы крови разделили на две аликвоты: в одной аликвоте только определяли содержание СЖК, а во второй- содержание СЖК после переэтерификации ЭЖК.Относительное расхождение между результатами определения СЖК в двух аликвотах составило не более 15 %, что не превышает относительной ошибки метода, следовательно, на первой стадии пробоподготовки образование СЖК не происходит или происходит в незначительной степени.Процесс двухстадийного определения ЖК заключается в последовательном выполнении стадий переэтерификации ЭЖК в метиловые эфиры и экстрактивного метилированияСЖК. Переэтерификация ЭЖК протекает при pH > 11, в то время как экстрактивное алкилирование протекает при pH 8.
Таким образом, переход от первой стадии процедуры ковторой требует коррекции рН пробы. Для решения этой проблемы разработали три варианта создания необходимого pH в пробе: добавка серной или соляной кислот и разбавлениепробы фосфатным буфером с pH 8. Коэффициенты извлечения пальмитиновой кислоты составили 5%, 10% и 73%, соответственно.
Количества реагентов, необходимые для достижения требуемого pH среды, определяли титриметрически. Установили, что наибольший выход продуктов реакции экстрактивного метилирования достигается при коррекции рН с помощью фосфатного буферного раствора.Для определения содержания ЖК в плазме крови использовали метод относительнойградуировки с внутренним стандартом. Градуировочные графики строили по стандартнымрастворам метиловых эфиров ЖК в дихлорметане.
В качестве внутреннего стандарта использовали дейтерированную пальмитиновую кислоту d31, которую добавляли в анализируемый образец в виде свободной кислоты (для определения СЖК) и в виде метиловогоэфира (для определения ЭЖК).Процесс построения градуировочных графиков осложнен различными биогеннымиуровнями содержания в крови свободных и связанных ЖК. Требования к диапазону определяемых концентраций метиловых эфиров ЖК после первой и второй стадий подготовкипроб не совпадали. Так, например, содержание свободной линолевой кислоты в плазмекрови человека составляет 15-70 мкг/мл, а в этерифицированном виде может достигать 600мкг/мл. Для повышения воспроизводимости анализа градуировочные графики были разбиты на линейные диапазоны для высоких и низких концентраций.
На рисунке 15 представлены масс-хроматограммы ЖК зарегистрированные по характеристичным ионам в плазмекрови.63A b u n d a n c eT IC :E T _ 8 .D \ d a ta .m s2 0 0 0 0 01 5 0 0 0 01 0 0 0 0 05 0 0 0 01 4 . 0 01 6 . 0 01 8 . 0 02 0 . 0 02 2 . 0 02 4 . 0 02 6 . 0 02 8 . 0 03 0 . 0 0T im e - - >A b u n d a n c eT IC :F _ 8 5 .D \ d a ta .m s(* )2 0 0 0 0 01 5 0 0 0 01 0 0 0 0 05 0 0 0 01 4 .
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
