Диссертация (1150042), страница 12
Текст из файла (страница 12)
PCA – principal component analysis) [196]. Прианализе данных методом PCA особое внимание уделяется графикам счетов и нагрузок, которые несут в себе информацию о распределении данных. На графике счетов каждый образец изображается в координатах t1 и t2 (старшие главные компоненты ГК1 и ГК2) или вкоординатах младших компонент t3, t4 и пр.
Близость двух точек означает их схожесть, т.е.положительную корреляцию. Точки, расположенные под прямым углом, являются некоррелированными, а расположенные диаметрально противоположно – имеют отрицательнуюкорреляцию. График нагрузок при этом используется для исследования роли переменных.На графике нагрузок каждый образец изображается в координатах p1 и p2. Анализ графиканагрузок позволяет установить, какие переменные коррелируют друг с другом.503 Результаты и их обсуждение3.1 Хроматографическое разделениеПри разработке методики нами было проведено сравнение эффективности разделения метиловых эфиров ЖК на капиллярных колонках: HP-FFAP Polyethylene Glycol,SUPELCO SPB-1701 30 м, 0,250 мм, 0,25 мкм и HP-5MS 30 м, 0,25 мм, 0,25 мкм [2].Режимы программирования температуры при использовании колонки HP-FFAP Polyethylene Glycol: начальная температура термостата 50°С, конечная 200 °С, скорость подъема температуры варьировали от 5 °С/мин до 20 °С/мин, в том числе с использованием“ступенчатого” температурного градиента.Форма хроматографических пиков наиболее легких компонентов смеси симметрична, однако при достижении температуры выхода 200 °С форма пиков тяжелых компонентов не позволяла провести количественную оценку их площадей.
Можно предположить,что увеличение конечной температуры до 300 °С позволило бы добиться правильнойформы пиков тяжелых компонентов, однако диапазон допустимых рабочих температур неподвижной фазы FFAP меньше этой температуры.Режимы программирования температуры при использовании колонки SUPELCOSPB 1701 30 м, 0,250 мм, 0,25 мкм: начальная температура термостата 50 °С, конечная 240°С, скорость подъема температуры варьировали от 5 °С/мин до 20 °С/мин, в том числе сиспользованием “ступенчатого” температурного градиента.
Оказалось, что с использованием SPB-1701 разделение компонентов происходит еще худшим образом по сравнению сколонкойFFAP. На рисунке 9 представлены хроматограммы, полученые при использоваA b und a nceнии колокни FFAP и HP-5MS.T IC : g r a d _ 3 .D \ d a ta .m sT IC : G R A D _ 5 _ M IX _ 2 M G _ 5 .D \ d a ta .m s ( * )32000003000000280000026000002400000220000020000001800000HP-5MS1600000140000012000001000000800000600000FFAP4000002000004 5 .0 04 5 .5 04 6 .0 04 6 .5 04 7 .0 04 7 .5 04 8 .0 04 8 .5 04 9 .0 04 9 .5 05 0 .0 05 0 .5 05 1 .0 05 1 .5 0T im e -->Рисунок 9 - Масс-хроматограмма смеси метиловых эфиров ЖК по характеристичнымионам, при использовании капиллярных колонок HP-5MS и FFAP51Наименее полярная из рассмотренных, колонка HP-5MS, тем не менее, позволиладобиться разделения большинства целевых соединений, как показано на рисунке 10, за исключением пар кислот линолэлаидиновая и линоленовая, цис-11-эйкозеновая и цис11,14,17-эйкозатриеновая (температурный режим приведен в экспериментальной части).Масс-спектральные характеристики компонентов неразделенных пар позволяют проводитьих селективное определение.Рисунок 10- Масс-хроматограмма смеси метиловых эфиров ЖК по характеристичнымионам.
Капиллярная колонка HP-5MS 30 м, 0,250 мм, 0,25 мкм.3.2 Подготовка проб к анализуЭкстрактивное алкилирование СЖК проводили йодистым метилом с использованием хлористого метилена в качестве растворителя в присутствии катализатора межфазного переноса гидроксида тетрабутиламмония (ТБАГ) [2]. Была проведена оценка зависимости выхода метилпальмитата при алкилировании пальмитиновой кислоты от состава реакционной смеси; результаты приведены в таблице 12. Общий объем пробы составил 500мкл в растворе метанола.52Таблица 12 - Зависимость выхода метилпальмитата при алкилировании пальмитиновойкислоты в различных условиях [2].Выход продукта ,%Состав реакционной смеси2 мл буферного раствора + 70 мкл ТБАГ+ 100 мкл CH3I + 1 мл CH2Cl22 мл буферного раствора + 70 мкл ТБАГ+ 100 мкл CH3I + 2 мл CH2Cl22 мл буферного раствора + 140 мкл ТБАГ+ 100 мкл CH3I + 2 мл CH2Cl22 мл буферного раствора + 140 мкл ТБАГ+ 200 мкл CH3I + 1 мл CH2Cl255538291Дальнейшее увеличение количества реагентов не привело к повышению выхода реакции.
Степени извлечения/превращения ЖК при экстрактивном алкилированим из биологических образцов (плазмы крови и мочи) не отличаются от степеней извлечения из водныхрастворов.Необходимым условием количественного протекания реакции экстрактивного алкилирования является обеспечение взаимодействия между отдающей и принимающей фазами, поэтому значительное влияние на скорость реакции оказывает способ перемешиванияреакционной смеси.
При использовании ультразвуковой ванны для перемешивания в течение 10 минут выход реакции метилирования пальмитата составил всего лишь 30%, а прииспользовании механического перемешивающего устройства (т.н. вортекс) в течение 10минут выход реакции составил 90%. Увеличение времени перемешивании в вортексе непривело к повышению выхода реакции.Важно отметить, что для успешного определения ЖК в биологических образцах необходимым условием является правильный выбор лабораторной посуды для анализа. Так,при использовании любой пластиковой посуды для экстрактивного алкилирования, в образец привносились значительные количества пальмитиновой и стеариновой кислот. По этойпричине для вышеуказанной процедуры необходимо использовать только стеклянную посуду, а полученный раствор в дальнейшем можно хранить в любой посуде.
На рисунке 11представлены сравнение хроматограм, после проведения экстрактивного алкилированияобразца заведомо чистой воды, проведенного в пластиковой посуде и стеклянной53Abu n d an c eT6 0 0 0 0 0 05 5 0 0 0 0 0IC: M.D\ data.msПластиковая посуда5 0 0 0 0 0 04 5 0 0 0 0 04 0 0 0 0 0 03 5 0 0 0 0 03 0 0 0 0 0 02 5 0 0 0 0 02 0 0 0 0 0 01 5 0 0 0 0 01 0 0 0 0 0 05 0 0 0 0 01 0 .0 0TA1 2 .0 01 4 .0 01 6 .0 01 8 .0 02 0 .0 02 2 .0 02 4 .0 02 6 .0 02 2 .0 02 4 .0 02 6 .0 0im e - - >b u n d a n c eСтеклянная посудаTIC: Stek lo.D\ data .ms( * )6 0 0 0 0 0 05 5 0 0 0 0 05 0 0 0 0 0 04 5 0 0 0 0 04 0 0 0 0 0 03 5 0 0 0 0 03 0 0 0 0 0 02 5 0 0 0 0 02 0 0 0 0 0 01 5 0 0 0 0 01 0 0 0 0 0 05 0 0 0 0 01 0 .0 0Time1 2 .0 01 4 .0 01 6 .0 01 8 .0 02 0 .0 0- - >Рисунок 11- Масс-хроматограммы смеси метиловых эфиров ЖК по характеристичнымионам после экстрактивного алкилирования образца заведомо чистой воды, проведенногов пластиковой посуде и стекляннойПри анализе образцов плазмы необходима стадия депротеинизации.
Наиболее мягким вариантом этой процедуры является добавление смешивающегося с водой органического растворителя (метанола) с последующим осаждением белка центрифугированием.Однако длинноцепочечные ЖК (С ≥ 20), по-видимому, осаждаются вместе с белками, и врезультате выход их метиловых эфиров составляет не более 10%. В дальнейшем для повышения выхода “тяжелых” ЖК было решено исключить стадию депротеинизации плазмы, ареагенты добавлять непосредственно в образец, разбавляя пробу только буферным раствором. При этом на границе раздела фаз образуется белковая пленка, в которой, вероятно, иконцентрируются некоторые длинноцепочечные кислоты, поэтому для повышения степениих извлечения увеличили время перемешивания в вортексе до 15 минут.
Масс-хроматограммы экстракта из плазмы крови и стандартной смеси метиловых эфиров ЖК зарегистрированные по характеристичным ионам представлены на рис. 12. Различия обусловлены низким содержанием нечетных ЖК в плазме, в отличие от стандартной смеси.54-Стандартнаясмесьметиловыхэфиров ЖКAbundanceT IC : F r_ 3 6 .D \ d a ta .m sT I C : C a l_ 4 0 0 . D \ d a t a . m s ( * )- Образец плазмы800007500070000650006000055000500004500040000350003000025000200001500010000500002 1 .0 02 2 .0 02 3 .0 02 4 .0 02 5 .0 02 6 .0 02 7 .0 02 8 .0 02 9 .0 03 0 .0 0T im e - - >Рисунок 12 - Масс-хроматограмма реконструированная по характеристичным ионам стандартной смеси метиловых эфиров ЖК и образца плазмы послеэкстрактивного алкилированияСтепени извлечения СЖК из плазмы представлены в таблице 13.
При определенииЖК в моче столкнулись с проблемой, связанной с определением внутреннего стандарта.При внесении его в любом растворителе (в воде, в метаноле, дихлорметане, гексане) в мочуили в мочу с добавкой буфера, степень извлечения/превращения внутреннего стандарта составила не больше 2%. Но при добавлении в мочу двойного объёма метанола, а только потом фосфатного буфера и остальных реагентов, выход реакции составил порядка 84%. Таким образом порядок введения имеет большое значение. Степени извлечения СЖК из мочипредставлены в таблице 14.55Таблица 13 – Степени извлечения/превращения продуктов реакции экстрактивного алкилирования из плазмы кровиНаименованиеСтепеньсоединенияизвлечения/превращения, %Капроновая кислота58,5Капри́ловая кислота́72,2Каприновая кислота71,5Ундециловая кислота63,9Лауриновая кислота68,5Тридекановая кислота69,2Миристолениновая кислота68,0Миристиновая кислота76,4цис-10-пентадекановая кислота72,2Пентадекановая кислота79,6Пальмитолеиновая кислота88,8Пальмитиновая кислота69,5цис-10-гептадекановая кислота80,6Маргариновая кислота84,6Гамма-линоленовая кислота70,4Линолевая кислота55,8Олеиновая кислота67,7Линолаэдиновая кислота78,8Линоленовая кислота76,2Элаидиновая кислота83,1Стеариновая кислота81,9Арахидоновая кислота64,9цис-5,8,11,14,17-эйкозапентаеновая кислота62,1цис-8,11,14-Эйкозатриеновая71,4цис-11,14-эйкозадиеновая кислота73,4Гондоиновая (цис-11-эйкозеновая кислота)74,8цис-11,14,17-Эйкозатриеновая кислота70,3Арахиновая кислота81,4Генэйкозановая кислота74,3цис-4,7,10,13,16,19-докозагексаеновая кислота53,5цис-13,16-докозеновая кислота66,0Эруковая кислота68,5Бегеновая кислота72,8Трикозановая кислота64,9Нервоновая кислота55,4Лигноцериновая кислота65,7Пеларгоновая кислота (Нонановая кислота)72,3Энантовая кислота (гептановая кислота)84,5Нанодекановая кислота (Нанодециловая кислота)78,956Таблица 14 – Степени извлечения/превращения продуктов реакции экстрактивного алкилирования из мочиНаименованиеВыход реакции,%соединенияКапроновая кислота91,0Капри́ловая кислота́76,0Каприновая кислота82,5Ундециловая кислота81,4Лауриновая кислота81,4Тридекановая кислота80,8Миристолеиновая кислота86,8Миристиновая кислота80,6Цис-10-пентадекановая кислота78,2Пентадекановая кислота81,1Пальмитолеиновая кислота98,8Пальмитиновая кислота84,1цис-10-гептадекановая кислота87,2Маргариновая кислота83,1γ-линоленовая кислота79,7Линолевая кислота81,9Олеиновая кислота54,7Линоэлаидиновая82,0Линоленовая кислота80,0Элаидиновая кислота85,2Стеариновая кислота87,0Арахидоновая кислота83,2цис-5,8,11,14,17-эйкозапентаеновая кислота79,6цис-8,11,14-Эйкозатриеновая81,4цис-11,14-эйкозадиеновая кислота85,3Гондоиновая (цис-11-эйкозеновая кислота)82,5цис-11,14,17-Эйкозатриеновая кислота81,3Арахиновая кислота86,1Генэйкозановая кислота87,1цис-4,7,10,13,16,19-докозагексаеновая кислота79,0цис-13,16-докозеновая кислота85,0Эруковая кислота84,4Бегеновая кислота86,7Трикозановая кислота87,4Нервоновая кислота81,4Лигноцериновая кислота86,7Пеларгоновая кислота (Нонановая кислота)83,0Энантовая кислота (гептановая кислота)80,1Нанодекановая кислота (Нанодециловая кислота)76,5После экстракции дихлорметаном необходимо сконцентрировать и выпарить 2 млрастворителя.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
