Диссертация (1150042), страница 11
Текст из файла (страница 11)
В исследование участвовало 12 здоровых мужчин в возрасте 20-25 лет. Отборкрови у добровольцев проводили натощак, из кубитальной вены в пробирки для гематологии Vacuette с ЭДТА в качестве антикоагулянта.2.3 Определение оптимальных условий хранения и транспортировки биологическихобразцовОпределение СЖК и ЭЖК проводили c использованием разработанного двухстадийной методики. Отбор крови у добровольцев проводили из кубитальной вены в пробирки длягематологии Vacuette с ЭДТА в качестве антикоагулянта. Для получения плазмы кровь центрифугировали 15 мин при 4000 g.
Образцы плазмы были пулированы и затем аликвотированы. Перечень условий хранений различных аликвот приведен в таблице 10 [4]. Хранениеаликвот объемом 500 мкл производили в пробирках типа Eppendorf на 2 мл.Для предотвращения возможных реакций окисления в образцах, в серию аликвот перед хранением был добавлен ди-трет-бутилгидрокситолуол в концентрации 100 мкг на образец.Для определения влияния основного белка плазмы крови на определение ЖК былпроведен модельный эксперимент: приготовлен раствор HSA – человеческого сывороточного альбумина, свободного от ЖК (Sigma-Aldrich) концентрацией 40 мг/л, соответствующий естественной биогенной концентрации HSA в плазме крови человека.
Затем внесеныолеиновая и пальмитиновая кислоты в концентрации 20 мкг/мл. Образец разделили на триаликвоты, первую проанализировали незамедлительно, вторую хранили при -20 °С в течение 14 дней, третью – 28 дней. Условия хранения систематизированы в таблице 10.46Таблица 10 - Различные условия хранения аликвот плазмы крови [4]Описание условий храненияЗамораживание пробы до -20 °С, хранение 24 часа и размораживание до +20 1 цикл°С в течение двух часов при комнатной температуре. Затем следующий 2 циклцикл.3 цикл1 деньХранение пробы при +4 °С2 дня3 дняЗамораживание пробы до -20 °С, хранение 14 или 28 дней и разморажива- 14 днейние до +20 °С в течение двух часов при комнатной температуре28 днейЗамораживание пробы до -70 °С, хранение 14 или 28 дней и разморажива- 14 днейние до +20 °С в течение четырех часов при комнатной температуре28 дней1 циклДобавление в пробу ди-трет-бутилфенола и замораживание пробы до -20°С, хранение 24 часа и размораживание до +20 °С в течение двух часов при 2 циклкомнатной температуре.
Затем следующий цикл3 циклРазбавление пробы метанолом (1 к 2), охлаждение -20 °С, хранение 14 или 14 дней28 дней и нагрев до +20 °С в течение двух часов при комнатной температуре 28 днейВсе образцы были заморожены и разморожены однократно, за исключением исходного.2.4 Исследование влияния фосфорорганических соединений на профили жирныхкислот плазмы крови крысЭксперименты проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 180-230 г.Условия содержания экспериментальных животных соответствовали «Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (GLP)» (утв. Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19.06.2003 N 267). Для получения плазмы кровь, отобранную после декапитации крыс в пробирки с ЭДТА-К3, центрифугировали 15 мин при4000 g.В первом эксперименте использовали 5 групп животных [128].
Трем группам вводили ФОВ, одна группа получала только антидот, контрольная группа получала равныйобъем физиологического раствора. GD, GB и RVX вводили подкожно (п/к) в дозах 90, 45 и6 мкг/кг, соответственно (½DL50). Карбоксим (10 мг/кг) в смеси с атропином (30 мг/кг) [18]вводили внутримышечно сразу после отравления. Измерение показателей проводили через3 и 24 часа. На каждую временную точку было взято 3 животных. Исследовали качественный и количественный состав СЖК плазмы крови крыс.Во втором эксперименте использовали 3 группы животных.
Первой группе двукратно вводили п/к RVX в дозах 4,8 мкг/кг (2×0,4LD50) с интервалом 1 час, т.о. введенная47доза составила 9,6 мкг/кг. Второй группе после введения RVX, вводили карбоксим следующим образом: непосредственно перед употреблением содержимое одной ампулы разводили в физиологическом растворе (смешивали с 14 мл физ. раствора и стерилизовали фильтрацией) и вводили внутримышечно (в/м) из расчета 100 мкл/100 г веса тела сразу послевведения RVX. Контрольная группа получала равный объем физиологического раствора.Измерение показателей проводили через 3, 24, 72 часа и 1 неделю. На каждую временнуюточку было взято 6 животных. Измеряли качественный и количественный состав СЖК иЭЖК плазмы крови крыс.
Определение СЖК и ЭЖК проводили с использованием двухстадийной методики.2.5 Исследование влияния мельдония на профили жирных кислот плазмы кровипрактически здоровых добровольцевИсследование проводили с участием 12 практически здоровых мужчин 20-25 лет.Эксперимент разделили на два этапа: в ходе первого этапа у добровольцев в течение одногодня отбирали образцы плазмы крови, в ходе второго этапа добровольцы получали 2500 мгмельдония утром и у них также отбирали образцы плазмы крови по аналогичной схеме.Режимы питания добровольцев на двух этапах исследования одинаковые.Отбор крови у добровольцев проводили из кубитальной вены в пробирки для гематологии Vacuette с ЭДТА в качестве антикоагулянта.В первый день фонового тестирования у добровольцев отбирали образцы крови имочи в течение всего дня: фон, 15 мин, 30 мин, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов. Для уменьшениявлияния питания на фоновые значения клинико-биохимических показателей добровольцыполучали обед не ранее чем через два часа после отбора крови (после точки отбора “2 часа”).Расписание отбора проб плазмы крови после приема мельдония в точности повторяет фоновое тестирование.2.5 Исследование влияния фторацетата на профили жирных кислот плазмы кровикрысВ настоящей мы исследовали изменение содержания триглицеридов и СЖК послеострой интоксикации натриевой солью фторацетата у крыс; пероральная доза составила 2мг/кг (1/2LD50) [167].
Для экспериментальных исследований использовали белых крыс породы Wistar. Действие ФА оценивали при пероральном введении. Стандартные методы лабораторной диагностики включали в себя определение лактата, пирувата, цитрата, гликогена, глюкозы, триглицеридов, СЖК.482.6 Исследование влияния алифатических углеводородов на профили жирных кислот плазмы крови и тканей печени и головного мозга крыс.Эксперименты проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 180-230 г.Условия содержания экспериментальных животных соответствовали «Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (GLP)» (утв.
Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19.06.2003 N 267). Для получения плазмы кровь отбирали в пробирки с ЭДТА-К3 после декапитации крыс и центрифугировали 15 мин при 4000g.Для оценки токсических свойств смеси нормальных алифатических углеводородовС6-С10, а именно гексана, гептана, октана, нонана и декана (далее – УВ) был проведенхронический 90-суточный эксперимент. Смеси предельных углеводородов подавали вкамеры непрерывно в течении 90 суток с помощью специально сконструированногодозатора, позволяющего точно регулировать и постоянно поддерживать заданнуюконцентрацию смеси в камере в течение эксперимента.Таблица 11 - Концентрации компонентов смеси предельных углеводородов С6-С10Суммарное содержание смесиУглеводородУВ, мг/м3гексан C6H14гептан C7H16Группа 1(высокая160 ± 20,5октан C8H18доза)нонан C9H20декан C10H22гексан C6H14гептан C7H16Группа 2(средняя31,4 ± 5,6октан C8H18доза)нонан C9H20декан C10H22гексан C6H14гептан C7H16Группа 35,2 ± 1,1октан C8H18(низкая доза)нонан C9H20декан C10H22ГруппаСодержаниемг/м325,9104,725,91,81,85,020,35,00,340,340,843,40,840,060,06УВ,Концентрации УВ в воздухе при экспонировании животных были довольнонизкими: содержание гептана в смеси составляло всего 104,7 мг/м3 в первой группе, 20,3мг/м3 во второй и 3,4 мг/м3 в третьей.
Актуальность исследования влияния низкихконцентраций УВ согласуется с современными тенденциями в токсикологии, которыепредполагают исследование концентраций токсикантов, релевантных их содержанию вокружающейсреде.Соотношенияпредельных49углеводородоввсмесизаданысоотношениями их концентраций в атмосферном воздухе вблизи нефтеперерабатывающихзаводов, что наглядно представлено в таблице 11.После экспонирования у животных были отобраны образцы органов, которые незамедлительно заморозили в жидком азоте (-196°С) и гомогенизировали. К полученным гомогенатам массой от 80 до 120 мг добавляли раствор 4 мл КОН в метаноле, пробы тщательно перемешивали в УЗ-ванне в течении 10 минут, а затем в вортексе в течение 15 минут,затем проводили экстракцию метиловых эфиров 4 мл гексана дважды, экстракт выпаривалии определяли ЭЖК методом ГХ-МС.
В оставшийся раствор гидроксида калия для установления рН 7 добавляли фосфатный буфер, а затем проводили процедуру экстрактивного алкилирования иодистым метилом (200 мкл) в присутствии катализатора межфазного переноса ТБАГ (300 мкл). При увеличении веса образцов соответственно увеличивали количество реагентов.2.7 Статистическая обработка полученных результатовСтатистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью прикладного пакета программ «STATISTICA» (версия 6.0, StatSoft Inc, 2001) и Microsoft Excel2007 с дополнением Multibase 2015. В случае трех и более выборок различия по анализируемым показателям оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа(ANOVA) с последующим попарным межгрупповым сравнением величин по критерию Фишера.
Для выявления взаимосвязей между изучаемыми показателями вычисляли коэффициент корреляции Пирсона. Для всех видов анализа статистически значимыми по сравнению с контролем считали значения с р < 0,05. Результаты представлены как медиана (5%;95% перцентиль) [2,3,4,128].Факторный анализ данных проводили методом PLS-DA, который является частнымслучаем метода главных компонент (англ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
