Автореферат (1150041)
Текст из файла
На правах рукописиОрлова Татьяна ИгоревнаСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ДВУХСТАДИЙНОЙ МЕТОДИКИХРОМАТОМАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВОБОДНЫХ ИЭТЕРИФИЦИРОВАННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХСпециальность 02.00.02 – Аналитическая химияАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание учёной степеникандидата химических наукCанкт-Петербург2015Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии«Научно-исследовательскийинститутгигиены,профпатологиииэкологиичеловека» Федерального медико-биологического агентстваНаучный руководителькандидат химических наук, старший научныйсотрудниклабораториианалитическойтоксикологии ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА РоссииУколов Антон ИгоревичОфициальные оппоненты:докторхимическихнаук,руководительлаборатории исследований в области анализаобъектовокружающей«ВсероссийскийсредыФГУПнаучно-исследовательскийинститут метрологии им.
Д. И. Менделеева»Крылов Анатолий Ивановичдоктор химических наук, профессор, заведующийлабораториейхроматографииФГБУНфизико-химическихиосновхромато-масс-спектрометрии«Институтфизическойхимиииэлектрохимии им. А.Н. Фрумкина» РАН.Буряк Алексей КонстантиновичВедущая организация:Химический факультет, ФГОУВО «Московскийгосударственныйуниверситетим.М.В.Ломоносова»Защита диссертации состоится « 3 » марта 2016 г. в15.00 на заседаниидиссертационного совета Д 212.232.37 по защите докторских и кандидатскихдиссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу:199034, Санкт-Петербург, Средний проспект В.О., д. 41/43, БХА.С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. А.М.
Горькогопо адресу: 199134, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9. www.spbu.ru.Автореферат разослан«»Учёный секретарьдиссертационного совета/к.ф.-м.н. Панчук В.В./ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальностьХромато-масс-спектрометрические методы исследования профилейнизкомолекулярных соединений - метаболитов крови и другихбиологических образцов приобретают все большее значение в современнойтоксикологии и фармакологии. Исследование метаболических профилейвносит значительный вклад в развитие лабораторно-клиническойдиагностики, например, исследования маркеров обмена жирных кислот (ЖК)являются одним из ключевых направлений в ранней диагностике сердечнососудистых рисков и метаболического синдрома.
Изменения концентрацийЖК в свободной (СЖК) и этерифицированной (ЭЖК) формах являютсяследствием метаболической саморегуляции, а также маркерами пораженияили дисфункции органов, поэтому разработка методики совместногоопределения обеих форм большого числа ЖК весьма актуальна.Основной метод определения ЖК в сыворотке или плазме крови - этогазовая хроматография (ГХ) с пламенно-ионизационным детектированием, спредварительной жидкость-жидкостной экстракцией. В сочетании с массспектрометрическим детектированием, метод ГХ имеет ряд неоспоримыхпреимуществ как в части надежности идентификации аналитов, так вотношении чувствительности и селективности их определения.
Кнедостаткам метода ГХ при любом варианте детектирования относитсянеобходимость предварительной продолжительной дериватизации аналитовпри высоких температурах, что может спровоцировать неблагоприятныепобочные реакции, в частности изомеризацию непредельных ЖК и ихокисление, причем скорость окисления возрастает с повышением степенинепредельности кислоты. Таким образом, разработка мягких методовдериватизации необходима для повышения правильности и точностиопределения ЖК.Практика применения разработанной методики при выполнении медикобиологических исследований показала, что результаты анализа зависят отусловий хранения образцов плазмы крови. К условиям хранения можноотнести следующие параметры: продолжительность хранения, температура иколичество циклов замораживания и размораживания. Большой объемотобранных образцов приводит к большей продолжительности хранения, асоздание лабораторного “банка” образцов и применение различных методованализа приведет к увеличению количества циклов замораживания иразмораживания.
Исследования влияния количества таких циклов наконцентрации эндогенных соединений в образце стали особенноактуальными в связи с формированием крупных “банков” биологическихобразцов. Соблюдение надлежащих условий хранения и транспортировкибиологических образцов позволяет значительно снизить вариации врезультатаханализа,обусловленныехранением.Количественнаяхарактеристика влияния условий хранения биологических образцов позволитзначительно повысить точность и достоверность определения ЖК.3Настоящаяработапосвященасовершенствованиюметодикиколичественного хромато-масс-спектрометрического определения ЖК вбиологических образцах в целях установления механизмов воздействиятоксичных химических соединений на организм, что позволит внести вклад впрактику медико-биологических исследований, лабораторно-клиническойдиагностики, а также гигиенического регламентирования вредныххимических веществ.Цель работыРасширение аналитических возможностей методики хроматомассспектрометрического определения свободных и этерифицированных жирныхкислот в плазме крови, моче и образцах органов и тканей, и оптимизацияусловий хранения проб и пробоподготовки для диагностики воздействиятоксичных веществ на организм человека и животных.В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:1.
Выбрать условия, обеспечивающие возможность одновременногоопределения свободных и этерифицированных ЖК плазмы крови людей иживотных. Оптимизировать условия количественного определения ЖК вобразцах гомогенатов головного мозга и печени крыс. Произвести оценкуметрологических характеристик методики.2. Оценить адекватность существующих способов хранения проб дляопределения СЖК и ЭЖК плазмы крови людей и животных.3. Апробировать разработанную двухстадийную методику определения ЖКпри оценке влияния сублетальных доз фторацетата, фосфорорганическихотравляющих веществ: зарина, зомана, VR1, а также средств антидотнойтерапии (карбоксим и атропин) на качественный и количественный составСЖК и ЭЖК плазмы крови экспериментальных животных.4.
Апробировать разработанную двухстадийную методику при оценкевлияния лекарственных препаратов на примере мельдония на качественный иколичественный состав СЖК и ЭЖК плазмы крови человека.Научная новизнаВпервые предложена двухстадийная методика ГХ-МС-определенияСЖК и ЭЖК с использованием экстрактивного алкилирования. Доказано,что во время процедуры извлечения ЭЖК не происходит увеличенияконцентраций свободных жирных кислот, что свидетельствует об отсутствииконверсии ЭЖК в СЖК.В плане совершенствования методик анализа биологических пробустановлено, что внесение антиоксиданта, в частности 4-метил-2,6-ди-третбутилфенола, в плазму крови перед хранением не позволяет увеличитьвозможный срок ее хранения и допустимое количество цикловзамораживания/размораживания.Показано, что разработанная двухстадийная методика позволяетпроводить определение СЖК и ЭЖК в образцах гомогенатов печени и1Российское вещество типа Vx, RVX, О-изобутил-S-2-диэтиламиноэтилметилфосфонат.4головного мозга без каких-либо видоизменений и введения дополнительныхстадий подготовки и очистки проб.Получены новые сведения о влиянии фосфорорганических соединенийна метаболизм липидов: VR в дозе ½DL50 ингибирует ацетилхолинэстеразу,но не влияет на липидный обмен в первые 24 часа.
Увеличение дозы VR до2×0.4 DL50 приводит к нарушениям липидного обмена, а именно кувеличению концентраций этерифицированных (на 30%) и свободных формжирных кислот (на 81%) в плазме крови в течение недели после отравления.СравнениеизмененийпрофилейСЖКприотравлениифосфорорганическими отравляющими веществами (ФОВ) с последующейантидотной терапией и без нее демонстрирует, что антидотная терапиякарбоксимом способна купировать отставленные последствия отравления,связанные с нарушениями метаболизма липидов, но не эффекты ФОВ впервые часы после отравления.При интоксикации фторацетатом в тканях экспериментальных животныхглавными энергетическими источниками являются лактат, глутамат иглутамин.
Глюкоза и СЖК не являются энергетическими субстратами впервые часы после отравления, но могут быть утилизированы в болеепозднем периоде.Апробация двухстадийной методики при анализе плазмы крови и мочиздоровых добровольцев принимавших мельдоний позволила выявитьотсутствие естественного увеличения концентраций СЖК и ЭЖК в плазмекрови после приема пищи. Это может свидетельствовать об активациигликолиза, и преимущественном использовании глюкозы в качествеэнергетического субстрата, что приводит к замедлению процессов липолиза итранспорта липидов.
Положительным выявленным влиянием мельдония наметаболизм можно назвать снижение соотношения концентраций ω-6 и ω-3полиненасыщенных ЖК.Практическая значимость работыНа примере большой группы аналитов показана возможность адаптацииразработанной методики для хроматомасс-спектрометрического определенияСЖК и ЭЖК в биологических образцах. Перечень целевых соединенийвключает 12 насыщенных кислот (С11-С24) и 20 ненасыщенных кислот (С16С24), в том числе ω-3, ω-6, ω-9 и полиненасыщенные жирные кислоты.Оптимизированы условия хранения биологических образцов для повышениянадежности определения исходного состава СЖК и ЭЖК.Разработанная двухстадийная методика внедрена в практикудоклинических и клинических исследований в ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБАРоссии и использована при исследовании мельдония, фторацетата, зарина,зомана и VR без применения и с применением антидотных препаратов(карбоксима и атропина).
В дальнейшем предложенная методика может бытьиспользована в центрах профпатологии, медико-биологических НИИ,центрах Роспотребнадзора и токсикологических лабораториях.5Положения выносимые на защиту1. Двухстадийная хромато-масс-спектрометрическая методика совместногоколичественного определения свободных и этерифицированных жирныхкислот в плазме крови людей и лабораторных животных на принципахэкстрактивного алкилирования.2.Доказательства влияния условий хранения образцов плазмы крови насодержание в ней СЖК и ЭЖК и предложения по оптимизации условийхранения биологических образцов: более одного цикла замораживания иразмораживания приводит к увеличению концентраций СЖК и уменьшениюконцентраций ЭЖК в образце плазмы крови, хранение образца притемпературах -20 °С и -70 °С более 14 дней приводит к изменениямконцентраций ЖК разной направленности.3.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
