Автореферат (1150041), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Доказательства возможности использования гомогенатов органов и тканейв качестве исходных образцов для определения ЖК в свободной иэтерифицированной формах без введения дополнительных стадий ихразделения.4. Результаты, полученные при использовании разработанной методики влабораторно-клиническойдиагностикепригигиеническомрегламентировании вредных химических веществ, определении механизмовдействия токсичных соединений, а также на всех стадиях доклинических иклинических исследований лекарственных средств.Публикации и апробация работыМатериалы диссертационной работы опубликованы в 6 статьях вжурналах, рекомендованных ВАК и 3 тезисах докладов.
Результатыисследований представлены на международных и всероссийскихконференциях: “VIII Всероссийской конференции с международнымучастием молодых ученых по химии “Менделеев 2014” (Санкт-Петербург, 1-4апреля2014 г.); “LXXV Ежегодной итоговой научно-практическойконференции “Актуальные вопросы экспериментальной и клиническоймедицины – 2014” (Санкт-Петербург, 21-24 апреля, 2014 г.); “Российскомнаучном форуме “Актуальные вопросы фундаментальной медицины”(Екатеринбург, 23-25 октября 2014 г.).Структура и объем работыДиссертационная работа состоит из введения, обзора литературы,экспериментальной части, обсуждения полученных результатов (7 разделов),выводов, заключения и списка цитируемой литературы.
Работа изложена на119 страницах машинописного текста, содержит 44 рисунка и 28 таблиц,список использованных источников - 240 наименований.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫВо введении дано обоснование актуальности темы и сформулированыцели работы.1-я глава (обзор литературы) включает разделы, посвященныехарактеристике известных инструментальных методов определения ЖК.6Термин “жирные кислоты” объединяет химический класс ациклическиходноосновных карбоновых кислот с открытой цепью. В крови человека ЖКприсутствуют либо в свободном виде (СЖК), либо в виде ацильныхфункциональных групп (ЭЖК) в т.н. липидах, представленных тремяклассами соединений: холестерин и его эфиры, триглицериды ифосфолипиды. Среди всех видов биологических соединений в организме,именно липиды выделяются среди различных клеточных метаболитов своимзначительным химическим разнообразием.
Липиды представляют собойбольшую группу природных гидрофобных соединений с разнообразнойструктурой и биологическими функциями (см. рис. 1).OOR1OR2R1OOOOR3OГлицеролипидыHOOR2OHOOPOHOOOXO XOСфинголипидыГлицерофосфолипидыNHROROHЖирные кислотыROOСтеролыOOHOHЭйкозаноидыSCoAАцетил-КоАOOOOPOPOHOH OHИзопентенилпирофосфатOOnПренолыРисунок 1 - Разнообразие липидов плазмы крови. Взаимосвязи междуосновными категориями липидов показаны начиная с ацетил-КоА, которыйявляется строительным блоком в биосинтезе жирных кислот.ЖКподразделяютнанасыщенные,мононенасыщенныеиполиненасыщенные. Полиненасыщенные жирные кислоты подразделяют на 3группы - омега-9, омега-6 и омега-3 по месту расположения последнейдвойной связи по отношению к карбоксильной группе. Совокупностьконцентраций всех жирных кислот называют “профилем”. Специальнорассмотрены хроматографические методы определения ЖК, так как наиболеераспространённым методом их определения является газовая хроматографияс различными видами детектирования.
Метод ГХ требует предварительнойдериватизации ЖК, наиболее распространенным способом являетсяметилирование и получение триметилсилильных эфиров. В качестве агентадля переэтерификации ЭЖК наиболее часто используют безводный метанолс добавлением щелочного катализатора, например, KOH.7В качестве способа дериватизации и экстракции для определения СЖКнами выбрано экстрактивное алкилирование иодистым метилом. Прототипомпослужила процедура, описанная в работе [Крылов А.И. с соавт., 1991].Метод был нами впоследствии оптимизирован для ГХ-МС и распространённа другие биологические образцы, помимо плазмы крови (мочу и гомогенатыголовного мозга и печени крыс); список определяемых соединений расширенс 5 до 32 (включая важнейшие маркеры сердечно-сосудистых заболеваний полиненасыщенные ЖК), однако главным преимуществом сталавозможность определения ЖК в этерифицированной форме.
Селективноеопределение СЖК и ЭЖК в одной аликвоте образца позволяет значительносократить объем плазмы крови, требуемый для проведения анализа.Отдельный раздел посвящен характеристике известных данных овлиянии условий хранения биологических образцов на возможностьопределения ЖК.В заключительной части обзора дана характеристика ЖК какбиологических маркеров отравлений и различных патологий и пр.Во 2-й главе (экспериментальная часть) рассмотрены объекты и методыисследования, в том числе анализ органов и тканей и пр.Хромато-масс-спектрометрический анализ выполняли с использованиемгазового хроматографа Agilent 7890A, оснащенного автодозатором AgilentG4513A, с масс-селективным детектором Agilent 5975С (Agilent Technologies,США).Определение СЖК и ЭЖК в биологических образцах выполнялиследующим образом: образец плазмы крови объемом 0.1 мл отбирали встеклянную пробирку для центрифугирования вместимостью 15 мл,прибавляли по 10 мкл внутренних стандартов (раствор пальмитиновойкислоты-d31 с концентрацией 10 мкг/мл и раствор метилового эфирапальмитиновой кислоты-d31 с концентрацией 10 мкг/мл).
К полученномураствору прибавляли 1 мл 0.4 М раствора NaOH в метаноле, тщательноперемешивали в вортексе в течение 10 мин, затем добавляли 2 мл гексана иполученную смесь опять перемешивали 10 мин. После центрифугированияпробы верхний слой, содержащий ЭЖК, переносили в пробирки Эппендорф,выпаривали под током азота, перерастворяли в 100 мкл CH2Cl2 ианализировали методом ГХ-МС.
В оставшийся нижний слой, содержащийСЖК, добавляли 3 мл фосфатного буфера с рН 8, выдерживали вультразвуковой ванне в течение 5 минут, затем добавляли 200 мкл водногораствора гидроксида тетрабутиламмония (ТБАГ), 100 мкл CH3I и 3 млCH2Cl2. Полученную смесь тщательно перемешивали в течение 10 минут,затем центрифугировали и отделяли верхний водный слой. Оставшийсяорганический слой выпаривали под током азота, перерастворяли в 100 мклCH2Cl2 и определяли СЖК методом ГХ-МС.Статистическую обработку полученных результатов осуществляли спомощью прикладного пакета программ «STATISTICA» (версия 6.0, StatSoftInc, 2001) и Microsoft Excel 2007 с дополнением Multibase 2014.
В случае трехи более выборок, различия по анализируемым показателям оценивали с8помощью однофакторногодисперсионногоанализа (ANOVA)споследующим попарным межгрупповым сравнением величин по критериюФишера. Для выявления взаимосвязей между изучаемыми показателямивычисляли коэффициент корреляции Пирсона. Для всех видов анализастатистически значимыми по сравнению с контролем считали значения ср < 0.05.Для получения плазмы отобранную кровь центрифугировали 15 мин при4000 g.В 3-й главе (обсуждение результатов) рассмотрены основныерезультаты, полученные при совершенствовании двухстадийной методикиопределения СЖК и ЭЖК. Приведены результаты оценки влияния условийхранения биологических образцов на возможность определения в них СЖК иЭЖК.
Показана возможность определения СЖК и ЭЖК в гомогенатовголовного мозга и печени крыс с использованием разработанной методикибез дополнительной модификации. В заключительной части приведеныпримеры применения двухстадийной методики для оценки влиянияхимических соединений на метаболизм липидов.Раздел 3.1 посвящен разработке методики определения СЖК сиспользованием экстрактивного алкилирования.Рисунок 2 - Масс-хроматограмма смеси метиловых эфиров жирных кислотреконструированная по характеристичным ионам (см.
табл. 1). WCOTколонка HP-5MS 30 м, 0.250 мм, 0.25 мкм. “IS” – метилпальмитат-d31.При разработке методики было проведено сравнение эффективностиразделения метиловых эфиров ЖК на капиллярных колонках: HP-FFAPPolyethylene Glycol, SUPELCO SPB-1701 30 м, 0.250 мм, 0.25 мкм и HP-5MS30 м, 0.25 мм, 0.25 мкм.
Режимы программирования температурыварьировали, в том числе с использованием “ступенчатого” температурногоградиента.9Таблица 1 – Аналитические характеристики метиловых эфиров ЖК икоэффициенты превращения/извлечения при экстрактивном алкилированииСЖК из плазмы крови и мочиМетиловый эфир жирной кислотыКапроновая, С6:0*Гептановая (энантовая), C7:0Каприловая, C8:0Нонановая (пеларгоновая), C9:0Каприновая, C10:0Ундециловая, C11:0Лауриновая, C12:0Тридекановая, C13:0Миристиновая, C14:0Миристолеиновая, C14:1цис-10-Пентадеценовая, C15:1Пентадекановая, C15:0Пальмитолеиновая, C16:1n-7Пальмитиновая, C16:0цис-10-Гептадеценовая, C17:1Маргариновая, C17:0γ-Линоленовая, C18:3n6Линолевая, C18:2n6cОлеиновая, C18:1n9cЛиноленовая, C18:3n3Линоэлаидиновая, C18:2tЭлаидиновая, C18:1n9tСтеариновая, C18:0Арахидоновая, C20:4n6цис-5,8,11,14,17-Эйкозапентаеновая,C20:5Нонадекановая, C19:0цис-8,11,14-Эйкозатриеновая, C20:3n8цис-11,14-Эйкозадиеновая, C20:2цис-11-эйкозеновая, C20:1цис-11,14,17-Эйкозатриеновая,C20:3n11Арахиновая, C20:0Генэйкозановая, C21:0цис-13,16-Докозадиеновая, C22:2Эруковая, C22:1n9цис-4,7,10,13,16,19Докозагексаеновая, C22:6n3Бегеновая, C22:0Трикозановая, C23:0Нервоновая, C24:1n9Лигноцериновая, C24:0Пальмитиновая кислота-d31Коэфф.извл-я, %плазмамоча599185807276728372836481698169817681688772788081899970848187858370805682685576807982838582876583Вр.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
