Автореферат (1150041), страница 3
Текст из файла (страница 3)
уд-я,мин5.886.937.858.829.8811.1712.6814.3516.1416.9617.7717.9919.4719.8821.3221.6822.6322.9223.0323.0323.0523.1323.4725.7574**, 99320, 7974, 12729474, 14374, 14374, 21474, 22874, 24255, 20855, 22274, 25655, 23674, 27055, 25074,28479, 292294***296***292***294***296***74, 29879, 15025.8725.9826.0526.3626.4679, 20167, 35079,320322***292***62797173758077818583131314151626.5026.8828.4929.6129.67320***74, 32674, 34035032070817466698186878584161717181729.9030.0631.5532.6633.0119.4779, 9174, 35474, 36855, 34874, 3823015473655566-7987878187-1418171917-m/zsr, %1415101514181617111515121381012121112111411911Примечание: * – общепринятое краткое обозначение жирных кислот; ** – массовые числахарактеристических ионов, используемые для количественного определения, указаны первыми; *** –характеристичный ион только один.10В результате было установлено, что наименее полярная израссмотренных колонка HP-5 MS, позволила разделить большинство целевыхсоединений (рис.
2), за исключением пар кислот линолэлаидиновая илиноленовая, цис-11-эйкозеновая и цис-11,14,17-эйкозатриеновая. Тем неменее следует отметить, что, масс-спектральные характеристикикомпонентов неразделенных пар позволяют проводить их селективноеопределение.Экстрактивное алкилирование СЖК проводили CH3I в CH2Cl2 вприсутствии катализатора межфазного переноса - ТБАГ. Выявленооптимальное соотношение реагентов: 2 мл буферного раствора, 140 мклТБАГ, 200 мкл CH3I и 2 мл CH2Cl2 (см. табл. 2).Таблица 2 - Зависимость выхода метилпальмитата при алкилированиипальмитиновой кислоты в различных условиях.Состав реакционной смеси2мл буферного раствора + 70 мкл ТБАГ + 100 мкл CH3I + 1 мл CH2Cl22мл буферного раствора + 70 мкл ТБАГ + 100 мкл CH3I + 2 мл CH2Cl22мл буферного раствора + 140 мкл ТБАГ + 100 мкл CH3I + 2 мл CH2Cl22мл буферного раствора + 140 мкл ТБАГ + 200 мкл CH3I + 1 мл CH2Cl2Выход, %55538291При использовании ультразвуковой ванны для перемешивания в течение10 мин степень конверсии пальмитиновой кислоты составила всего лишь30%, а при использовании механического перемешивающего устройства (т.н.вортекс) степень конверсии составила 90% за аналогичный промежутоквремени.
Увеличение продолжительности перемешивания в вортексе непривело к повышению выхода продукта реакции.Важно отметить, что для успешного определения жирных кислот вбиологических образцах необходимым условием является правильный выборлабораторной посуды для анализа. Так, при использовании любойпластиковой посуды для экстрактивного алкилирования в образец поступализначительные количества пальмитиновой и стеариновой кислот. Поэтому дляэкстрактивного алкилирования необходимо использовать только стекляннуюпосуду, а полученные образцы в дальнейшем можно хранить в любой посуде.При анализе образцов плазмы необходима стадия депротеинизации.Наиболее мягким вариантом является добавление смешивающегося с водойорганического растворителя (метанола) с последующим осаждением белкацентрифугированием. Однако длинноцепочечные ЖК (С ≥ 20), по-видимому,осаждаются вместе с белками, и в результате выход их метиловых эфировсоставляет не более 10%.
В дальнейшем, для повышения выхода “тяжелых”ЖК исключили стадию депротеинизации плазмы, а реагенты добавлялинепосредственно в образец, разбавляя пробу только буферным раствором.При этом на границе раздела водной и органической фаз образуется белковаяпленка,вкоторой,вероятно,иконцентрируютсянекоторыедлинноцепочечные кислоты, поэтому для повышения степени их извлеченияувеличили продолжительность перемешивания в вортексе до 15 мин.Степени извлечения СЖК из плазмы представлены в табл. 1.11Таблица 3 – Метрологические параметры методики измерений СЖК и ЭЖКв плазме кровиЖКσr(Δ),% отн.С11:05С12:06С13:028С14:118С14:015С15:126С15:016С16:15С16:02С17:122С17:017C18:3n637C18:2n6c2C18:1n9c3C18:3n319C18:1n9t10C18:05C20:4n63C20:517C20:3n813C20:28C20:132C20:3n1134C20:027C21:019C22:67C22:233C22:1n931C23:064C24:018СЖКЭЖКσR(Δ),±Δ, %σr(Δ),σR(Δ),±Δ, %% отн.
отн.С*, мкг/мл% отн. % отн. отн.С, мкг/мл7140.02-0.16-**480.13-8.201415290.9-3.720390.04-0.100.08-0.1221420.26-1.522614270.3-0.913251.6-16.175101.4-6.117330.03-0.1912230.52-2.631510200.3-0.9594-361120.9-10.42458-19612420-7612240.5-2.01612230.3-0.716311.0-2.5106130.2-0.625480.5-8.0129180.3-1.837127-42612434-1034762 - 23012417-7011220.8-6.51310200.5-1.77135.5-25.068150.9-7.14728-7921210-2661284-20511211-5414271.9-27.01414270.4-5.910208-253231.0-4.99171.5-4.8126110.4-1.221400.7-2.1129170.3-0.719380.7-2.123430.1-0.52924460.1-0.214270.03-0.055911-563242.3-31.924470.00-0.3420400.18-0.33541060.00-0.244230590.00-0.2717320.20-0.59-Примечание: * - диапазон концентраций ЖК в плазме крови; ** - ЖК отсутствует в плазме крови вэтерифицированной форме.Стоит отметить интересный факт: при внесении внутреннего стандарта(дейтерированной пальмитиновой кислоты) в мочу в различныхрастворителях (вода, метанол, дихлорметан, гексан) или в мочу с добавкойбуферного раствора, степень извлечения и превращения внутреннегостандарта составляла не более 2%.
Проблему удалось решитьпредварительным добавлением в мочу двойного объема метанола, а затемфосфатного буферного раствора и остальных реагентов. При этом степеньконверсии пальмитиновой кислоты составила порядка 84%. Таким образом,порядок прибавления реагентов оказывает значительное влияние на выходреакции.В табл. 3 приведены метрологические параметры методики измеренийСЖК и ЭЖК: Показатель повторяемости (среднего квадратического12отклонения повторяемости) - σr(Δ), % отн., показатель воспроизводимости(среднеквадратического отклонения воспроизводимости) - σR(Δ), % отн.,показатель точности (Р = 0,95) - ± Δ, % отн., показатель правильности(границы, в которых находится неисключенная систематическая погрешностьметодики) приведены в таблице 1.Раздел 3.2. посвящен разработке методики совместного определенияСЖК и ЭЖК с использованием экстрактивного алкилирования.Разработанная процедура основана на сочетании “классической”переэтерификации раствором KOH в MeOH и разработанного нами методаопределения СЖК с использованием экстрактивного алкилирования.
Такаяпроцедураподготовкипробхарактеризуетсянебольшойпродолжительностью, “мягкими” условиями и высокими выходамипродуктов реакции. Объединение стадий экстракции и получения летучихпроизводных позволяет работать с различными биологическими жидкостямибез дополнительных стадий депротеинизации и фильтрации. Схемапоследовательного определения СЖК и ЭЖК приведена на рис.
3.Рисунок 3 - Схема последовательного определения СЖК и ЭЖК в образцахплазмы кровиПри переходе от первой стадии - переэтерификации ЭЖК в метиловыеэфиры и экстракции их из матрицы ко второй - экстрактивномуметилированию СЖК - предложено проводить коррекцию рН пробы путемразбавления фосфатным буфером (рН 8).
Разработанная процедура позволяетпроводить количественное определение ЖК в плазме крови на уровнереальных биологических концентраций.Таблица 4 – Изменения концентраций СЖК после переэтерификацииСЖКЛауриновая кислотаПальмитиновая кислотаАрахидоновая кислотаКонцентрации СЖК, мкг/млИсходнаяКонечная2.52.743.448.235.532.0Δ, %7.67.47.3Щелочная среда в пробе в течение первой стадии может приводить кзавышенным результатам определения СЖК. Для выявления процессагидролиза ЭЖК образец плазмы крови разделили на две аликвоты: в однойаликвоте определяли только содержание СЖК, а во второй аликвоте13определяли содержание СЖК после переэтерификации ЭЖК.
В результатепоказано отсутствие конверсии ЭЖК в СЖК в ходе процедуры (см. табл. 4).Относительная ошибка определения большинства ЖК менее 15 %.Диапазон измеряемых концентраций составил от 0.2 до 800 мкг/мл.Раздел 3.3. Посвящен количественной оценке влияния условийхранения биологических образцов на исходный состав СЖК и ЭЖК. Дляопределения влияния температуры и продолжительности хранениябиологических образцов, отобранная у добровольца плазма крови быларазделена на несколько аликвот. Перечень условий хранения различныхаликвот и полученные при этом результаты приведены в табл. 5.Таблица 5 – Различные условия хранения аликвот плазмы кровиОписание условий храненияЗамораживание пробы до -20 °С, хранение 24 часа иразмораживание до +20 °С в течение двух часов при комнатнойтемпературе. Затем следующий цикл.Хранение пробы при +4 °СЗамораживание пробы до -20 °С, хранение 14 или 28 дней иразмораживание до +20 °С в течение двух часов при комнатнойтемпературеЗамораживание пробы до -70 °С, хранение 14 или 28 дней иразмораживание до +20 °С в течение четырех часов прикомнатной температуреДобавление в пробу ди-трет-бутилфенола и замораживаниепробы до -20 °С, хранение 24 часа и размораживание до +20 °Св течение двух часов при комнатной температуре.
Затемследующий цикл1 цикл2 цикл3 цикл1 день2 дня3 дня14 дней28 дней14 дней28 дней1 цикл2 цикл3 циклРезультатОтсутствуютизменения в составеСЖК↑, ЭЖК↓СЖК↑↑, ЭЖК↓↓ЭЖК↓, СЖКстабильны втечение двух днейСвободнаядокозагексаеноваякислота ↓Значимыеизменения в составеЭЖК и СЖКДобавлениеантиоксиданта неповлияло нарезультатыРазбавление пробы метанолом (1 к 2), охлаждение -20 °С,Значительныехранение 14 или 28 дней и нагрев до +20 °С в течение двух14 днейизменения в составечасов при комнатной температуреЭЖК и СЖКПримечание: ↑ - увеличение определяемых концентраций после предварительного хранения, ↓ уменьшение определяемых концентраций, ↑↑ и ↓↓ - значительные измененияРезультаты различных исследований влияния условий хранения насостав ЖК плазмы крови во многом противоречивы и получены разнымиметодами, что и является одним из показателей актуальности данной работы.Известны свидетельства об увеличении концентраций СЖК и уменьшенииконцентраций ЭЖК при хранении, а также свидетельства в пользунеизменности состава.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
