Диссертация (1150007), страница 14
Текст из файла (страница 14)
100 μg/mlsodium pyruvate1 mML-glutamine2 mMCell lysis buffer (made in distilled H2O)HEPES (pH 7.6)50 mMNaCl150 mMMgCl21.5 mMNa4P2O7 x 10 H2O10 mMEDTA2 mMGlycerol10 % (v/v)Triton X-1001.5 % (v/v)Na-Fluoride100 mM103Na-Orthovanadate (Na3VO4)2.7 mMProtease Inhibitor Cocktail Tablet1 (/10 ml)EDTA1 % (w/v) in PBSTrypsin/EDTA0.05 %/0.02 % (w/v) in PBSPBS (10 x)NaCl0.86MNa2HPO40.58MNaH2PO4xddH2O0.17MTBS (10 x)Tris-HCl (pH 7.6)0.1 MNaCl1.5 MTBS-TTBS1xTween0.1 %SDS-PAGE gel (10 %, 2 mini gels)H2O4.02 ml30 % acrylamide solution3.3 ml1.5 M Tris (pH 8.8)2.5 ml10 % SDS100 μl10 % Ammonium Persulfat50 μlTemed30 μlКлетки культуры MCF-7 и MELN выращивали в среде DMEM (Dulbecco’sModified Eagle’s Medium) c добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка (FBS). За три дня до эксперимента клетки культивировали в чашках Петри всреде с добавлением 10% DCC-FBS (приготовлена по методу Migliaccio et al.(1993)) при 37ºС в атмосфере 5% СО2Культивирование клеток MCF7 и MELN104Удаляли культуральную среду из чашки Петри, клетки промывали 2 мл рра EDTA 3-4 мин.
После этого клетки инкубировали с 3-4 мл р-ра трипсин/EDTA в течение 5 мин. Процесс останавливали добавлением равного объемасреды M3. Далее переносили клетки в 15мл/50мл пробирку Фалькона (Falcontubes) и центрифугировали при 1000 об/мин 5 мин, после чего среду удаляли,клетки ресуспензировали в культуральной среде. Число клеток в клеточнойсуспензии определяли подсчетом с помощью гемацитометра Нойбауэра. Далеепомещали необходимое число клеток в лунки необходимого для экспериментапланшета.Оценка гормональной активности соединений методом определенияактивности люциферазы (luciferase assay)Помещали MELN-клетки в 6-луночный планшет в количестве 3 x 105 клеток на лунку в среде с добавлением 10% DCC-FBS (M3, 2 мл на лунку). Через24 ч клетки помещали на следующие 24 ч в среду, содержащую 2% DCC-FBS.Далее клетки стимулировали исследуемым соединением.
По истечению инкубационного периода (16 ч.) отмывали клетки от культуральной среды 100 мклPBS, лизировали в течение 30 мин при 0°C инкубированием со 150 мкл лизирующего буфера. Затем собрали клетки скребком, ресуспендировали лизаты ипереносили их в промаркированные микропробирки Эппендорфа. Далее центрифугировали лизаты в течение 10 мин при 4°C. Для избавления от осадка лизаты переносили в новые микропробирки Эппендорфа. Смешивали в кювете100 мкл реагента «luciferase assay reagent» (Promega, Mannheim, Germany) с 20мкл полученного лизата клеток и измеряли люминесценцию в течение 1 минуты на люминометре Luminometer Biolumat LB9505, Berthold, Bad Wildbad, Germany. Люциферазную активность (cpm/mg белка) расчитывали нормированиемлюминесценции (выраженную в количестве в минуту) к концентрации белка влизате.105Определение пролиферативной активности соединений (Proliferationassay)Помещали MCF-7 клетки в 96-луночный планшет в количестве 104 клетокна лунку в среде с добавлением 10% DCC-FBS (M3).
Через 24 ч клеткипомещали на следующие 24 ч в среду, содержащую 1% DCC-FBS. Далее клеткистимулировали исследуемым соединением. По истечению инкубационногопериода (72 ч) клетки промывали 100 мкл PBS, фиксировали в течение 5 мин100 мкл 3% р-ра параформальдегида в PBS и окрашивали в течение 10 мин 100мкл 1%-ного р-ра красителя crystal violet, растворенного в 10%-ном этаноле.Избыток красителя crystal violet удаляли из лунок, после чего планшеттщательно промывали водой для удаления остатков красителя. После сушки навоздухе осевший на поверхности краситель растворяли в 100 мкл 10%-нойуксусной кислоты. Оптическую плотность определяли при длине волны 595 нмс помощью прибора Multiscan MX, Thermo, Dreieich, Germany.Вестерн БлоттингКонцентрацию белка в лизате клеток определяли с помощью набора «BioRad DC Protein Assay».
Градировочный график строили по данным измерениязначений абсорбции (750 нм) образцов с известными концентрациями белков(от 0,25 до 2 мг/мл)Помещали MCF-7 клетки в 6-луночные планшеты в количестве 3 x 105клеток на лунку в среде M3. Через 30 ч. стимулировали клетки исследуемымсоединением. По истечению инкубационного периода (16 ч.) клетки дваждыпромывали PBS и лизировали 100 мкл буфера для лизиса содержащегоингибиторы протеазы. Далее проводили количественный анализ содержаниябелка в исследуемых растворах и подготавливали пробы для электрофореза наполиакриламидном геле SDS. Через 24 ч.
наносили по 5 мкг каждого образца надва 10% геля полиакриламида и разделяли смесь белков электрофорезом принапряжении 100 вольт. После сепарации осуществляли блоттинг гелей намембраны PVDF (Immobilon-P, Millipore, Eschwege, Germany) в течение 3 ч.106После блоттинга мембраны промывали в Western-промывочном буфере (TBS-T,с содержанием 0,1% Tween-20), блокировали в течение 1 ч в 5% BSA (бычийсывороточный альбумин), растворенном в TBS-T. Мембраны обрезали науровне, соответствующем 55 кДа. Верхние половинки инкубировали в течениеночи при 4°С с ER-α антителами, растворенными в TBS-T, содержащем 5%BSA. Нижние половинки инкубировали с бета-актин-антителами в качествеконтроля (уровень экспрессии бета-актина не меняется в течение инкубации сE2 и исследуемым соединением).
Через 24 ч мембраны промывали 3 раза втечение 15 мин раствором TBS-T, а затем инкубировали в течение 1 ч совторичными антителами, коньюгированными с HRP (horse radish peroxidaseпероксидаза хрена).После этого мембраны снова промывали и детектировали методом ECL(усиление хемилюминесценции), используя рентгеновскую пленку на системе«ECL-plus» (GE Healthcare Biotech, Freiburg, Germany).Выделение липопротеинов низкой плотностиПробы крови брали у здоровых мужчин (N = 5) с помощью ЭДТА-содержащих вакуумных пробирок.
Плазму отделяли центрифугированием в течение15 мин при 4оС при 2500g. Липопротеины плазмы крови выделяли путем последовательного ультрацентрифугирования [123] с помощью ультрацентрифугиBeckman Optima LE-80K в «Ti 50,4» роторе. Липопротеины очень низкойплотности (ЛПОНП) выделяли при плотности d = 1.006 г/мл (270000g, 3.5 ч,+10◦С), после чего выделяли липопротеины низкой плотности (ЛПНП) в диапазоне плотностей 1.019-1.063 г/мл (160000g, 17 ч, +10°С). Фракции ЛПНП хранили в защищенном от света месте при -70°С. Исследование было одобреноэтическим комитетом Центральной больницы Хельсинкского университета, исогласие субъектов было также получено.Эксклюзионная хроматография. Выделенные ЛПНП очищали гель-хроматографией на колонке Sephadex G25 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden).
2мл образца наносили на колонку (размер колонки 1 см × 20 см, BioRad). ЛПНП107элюировали фосфатным буфером (PBS, рН 7.4), определяли концентрацию белков [124]. Фракции, содержащие липопротеины, объединяли и использовали вэкспериментах.Окисление ЛПНП. Антиоксидантная активность аналогов эстрогенов определялась путем непрерывного мониторинга кинетики формирования диеновых коньюгатов методом Эстербауера [125].
Исследуемый стероид растворялив этаноле и добавили к ЛПНП (концентрация белка 0,10 мг/мл в PBS). Контрольные эксперименты без добавления эстрогенов были сделаны с добавлениемтого же количества этанола. Каждый эксперимент включал две серии с 17β-эстрадиолом, концентрации 17β-E2, добавленного к ЛПНП, составляли 0,1мкмоль/л и 1 мкмоль/л. Далее липопротеиды подвергались окислению ионамиCu2+ путем добавления 1,66 мкМ раствора сульфата меди (II). Оптическуюплотность измеряли на УФ-спектрофотометре (Safire, TECAN, АвстрияGes.m.b.H) при длине волны 234 нм каждые 3 мин в течение 10 ч при постоянной температуре 28°С. Управление прибором осуществлялось с помощьюпрограммного обеспечения «Magellan» (TECAN, Австрия Ges.m.b.H).Анализ кинетики окисления.
Время, в течение которого антиоксидантыпредотвращают окисление ЛПНП и образование диеновых коньюгатов называется лаг-фазой (lag time). Лаг-фаза была рассчитана по методу, описанному в[25]. Для каждой концентрации исследуемого стероида рассчитывали приращение значение лаг-фазы по формуле: (лаг-фаза ЛПНП с добавлением стероида/лаг-фаза ЛПНП с растворителем) х 100%. Результаты выражали в виде«среднее ± стандартное отклонение в параллельных экспериментах». Статистические сравнения были сделаны с помощью программного обеспечения «SPSSStatistics 19.0». Предел достоверности:Р <0,05.108ВЫВОДЫ1.
С целью поиска модифицированных эстрогенов с кардиопротекторнымдействием, не опосредованном ядерным α-рецептором эстрогенов, синтезирован 16,16-диметил-2-фтор-D-гомо-8α-эстра-1,3,5(10)-триен-17а-он, обладающий указанными свойствами. Это открывает принципиальную возможностьполучения нового класса кардиопротекторов.2. Улучшены некоторые стадии полного синтеза аналогов стероидныхэстрогенов, содержащих фтор в положении 2.
Предложен альтернативный путьсинтезапромежуточного6-метокси-7-фтор-тетралина,позволяющийзначительно сократить схему синтеза.3. Стереоселективность каталитического гидрирования торговских эстрапентаенов, содержащих фтор в положении 2 и гидроксильную группу в положении 3, сильно зависит от условий реакции. При гидрировании в МеОН в присутствии Pd/C схема получения аналогов 8α-ряда сокращается с 4 стадий до 1.4. Предложен способ синтеза 2-фтораналогов стероидных эстрогенов сцис-сочленением колец С и D.5. При комбинированном действии 17аβ-ацетокси-3-метокси- 2-фтор-Dгомо-1,3,5(10)-эстратриена и урсоловой кислоты не происходит повышенияуровня триглицеридов при сохранении гипохолестеринимического действия.6.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
