Диссертация (1145983), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Для последующегопроведения эмульсионной ПЦР каждую библиотеку разводили до концентрации 11 пкмоль/мклсогласно протоколу.Проведение эмульсионной ПЦР и обогащения микросфер. Эмульсионную ПЦР иобогащение микросфер проводили согласно инструкции к набору реагентов "Ion OneTouch™200 Template Kit v2 DL" ("Thermo Fisher Scientific Inc.", США) при помощи аппарата Ion OneTouch v2 ("Thermo Fisher Scientific Inc.", США). Для контроля качества микросфериспользовали флуориметр "Qubit 2.0" ("Invitrogen", США) и набор реагентов "Ion Sphere™55Quality Control" ("Thermo Fisher Scientific Inc.", США).
Расчёты производили с помощьюпрограммы "Qubit® 2.0 Easy Calculator" ("Invitrogen", США). Секвенирование проводили приналичии матрицы в 10-30% "необогащенных" микросфер и в >50% "обогащенных".Секвенирование. Для секвенирования использовали весь объем микросфер. Реакциюпроводили, используя набор реагентов "Ion PGM™ Sequencing 200 Kit" ("Thermo FisherScientific Inc.", США) и микрочип "Ion 318™ Chip" ("Thermo Fisher Scientific Inc.", США).Секвенирование проводили на приборе "Ion Torrent PGM" ("Thermo Fisher Scientific Inc.", США)согласно руководству по эксплуатации и соответствующим инструкциям: "Torrent Suite 3.4.1"("Thermo Fisher Scientific Inc.", США) и "Ion PGM™ Sequencing 200 Kit".2.7 Статистическая обработка данныхСтатистический анализ проводился с помощью прикладных программ STATISTICAv.10.0 (Statsoft Inc., США), GraphPad Instat v.3.05 (GraphPad Software Inc., США), MDR 2.0.
beta8.4 (http://www.multifactordimensionalityreduction.org/), MedCalc v.16.8.4.Анализ клинических и анамнестических данных. Для оценки качественныхпризнаков вычисляли долю (%) признака. Слева и справа от полученных значений в видеподстрочных индексов указывали границы 95%-го доверительного интервала (95%ДИ).Значимость различий между группой больных с гестозом и группой сравнения покачественным признакам оценивали с помощью двустороннего точного критерия Фишера (p).Критический уровень статистической значимости принимали равным 0,05. При наличиистатистически значимых различий между группой пациенток с гестозом и группой сравнения,вычисляли коэффициент соотношения шансов (ОШ) [Lau et al., 1997].
Соотношение шансовуказывали с 95%ДИ.Оценку количественных признаков проводили после проверки на нормальностьраспределения их значений (критерий Шапиро–Уилка). Для нормально распределенныхпеременных рассчитывали среднее и 95%ДИ среднего. Для величин, распределение которыхотличалось от нормального, определяли медиану и интерквартильный интервал (25-й и 75-йпроцентили). Сравнительный анализ между группой больных с гестозом и выборкой женщинбез осложнений беременности по количественным признакам с нормальным распределениемпроводили с помощью t-критерия Стьюдента, при отклонении от нормального распределения теста Колмогорова-Смирнова и критерия Манна-Уитни. Статистически значимыми считалиразличия при р<0,05 [Гланц, 1999].56Анализ генетических данных.
Для оценки вклада генетических факторов в развитиигестоза определяли частоты (%) генотипов и аллелей изучаемых изменений нуклеотидныхпоследовательностей в группе или подгруппах пациенток с гестозом и женщин без осложненийбеременности. Слева и справа от полученных значений в виде подстрочных индексовуказывали границы 95% ДИ.
Оценку соответствия распределений генотипов ожидаемымзначениям при равновесии Харди-Вайнберга и сравнение распределений частот генотиповмежду анализируемыми группами проводили с помощью критерия χ2 Пирсона. Для сравнениячастот генотипов и аллелей по каждому из изменений между группами использовалидвусторонний точный тест Фишера (p). Статистически значимыми считали различия в случаер<0,05 [Гланц, 1999].
При попарном сравнении нескольких групп беременных использовалипоправку Бонферрони (рcor) [Гланц, 1999]. При наличии статистически значимых различиймежду группой с гестозом и группой сравнения, вычисляли ОШ и 95% ДИ.Для поиска сочетаний изучаемых изменений нуклеотидных последовательностей,ассоциированных с гестозом, использовали метод непараметрического кластерного анализаMDR (Multifactor Dimensionality Reduction) [Ritchie et al., 2003].
Значимость влияния сочетанийна риск развития гестоза оценивали с помощью двустороннего точного теста Фишера ивычисляли значения ОШ с 95% ДИ. Результаты считали статистически значимыми при p<0,05.Прогностические возможности генетических маркеров, показавших ассоциацию сгестозом, оценивали по величине AUC (площадь под ROC-кривой). Для полученных значенийAUC указывали границы 95% ДИ. Величину AUC интерпретировали в соответствии сэкспертной шкалой [Румянцев и др., 2009]: 0,5-0,6 – плохой классификатор; 0,6-0,7 – среднийклассификатор; 0,7-0,8 –хороший классификатор; 0,8-0,9 – высокое качество классификатора,0,9-1,0 – отличный классификатор.Сравнение количественных показателей (биохимических и инструментальных) убеременных с гестозом с разными генотипами проводили после проверки на нормальностьраспределения их значений (критерий Шапиро–Уилка). Для показателей с нормальнымраспределением при сравнении трех подгрупп пациенток с разными генотипами использовалиоднофакторный дисперсионный анализ (F-критерий Фишера).
Значимость различий междудвумя подгруппами с разными генотипами проверяли с помощью t-критерия Стьюдента. Приотклонении от нормального распределения, для сравнения трех подгрупп по интересуемомупризнаку использовали тест Краскела-Уоллиса (H), различия между двумя подгруппамиоценивали при помощи критерия Манна-Уитни.
Статистически значимыми считали различия вслучае р<0,05 [Гланц, 1999].572.8 Анализ результатов секвенированияПервичные результаты секвенирования экспортировали из программного обеспечения«Torrent Server» в виде fastaq файлов согласно инструкции «Torrent Suite 3.4.1» ("Thermo FisherScientific Inc.", США). Дальнейший анализ производили с помощью программного комплексаCAP-miRSeq (Comprehensive Analysis Pipeline for deep microRNA sequencing) [Sun et al., 2014] набазе кафедры компьютерных технологий СПбГУ ИТМО. На первом этапе осуществлялиобрезку нуклеотидов низкого качества с 3’ конца ("тримминг"). Далее из данных исключалипоследовательности адаптеров "Ion Adaptors", используя программу Cutadapt [Martin, 2011].Затем проводили фильтрацию данных по длине, удаляли чтения(секвенированныепоследовательности) длиной менее 17 нуклеотидов (программа Cutadapt [Martin, 2011]).
НаследующемэтапеоценивалидолюмикроРНКсредивсехсеквенированныхпоследовательностей. Для этого проводили картирование отфильтрованных данных нааннотацию известных транскриптов (GENCODE,v18) с помощью программы Bowtie [Langmeadet al., 2009]. Количество картированных последовательностей на участки генов различныхмолекул РНК оценивали, используя программу HTseq–count [Sun et al., 2014].
Сравнительныйанализ по числу чтений между группами женшин с гестозом и без осложнений беременностипроводили с помощью критерия Манна-Уитни. Для идентификации микроРНК чтениякартировали на референсный геном человека hg19 и базу известных микроРНК mirBase 21.0 спомощью программы Bowtie [Langmead et al., 2009]. Далее оценивали уровень содержанияобнаруженных микроРНК с помощью программы miRDeep2 [Friedlander et al., 2012].Сравнительный анализ содержания микроРНК проводили, используя программный пакет edgeR[Robinson et al., 2010]. Поправку на множественные сравнения проводили с помощью подходаметода Бенжамини-Хохберга [Benjamini and Hochberg, 1995]. Статистически значимым считалиизменение содержания микроРНК при скорректированном значении рcor<0,05.
Для оценкисодержанния каждой микроРНК в плацентах пациенток с гестозом по сравнению с нормойрассчитывали показатели FC (fold change - кратность изменения содержания) и log2FC [Sun etal., 2014].58ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ3.1 Связь вариантов исследуемых полиморфных сайтов с развитием гестоза3.1.1 Клиническая характеристика исследуемых группДанные анамнеза. Медиана возраста в группе пациенток с гестозом составила 30,0 лет(интерквартильная широта — от 26,0 до 34,0 лет) и оказалась статистически значимо выше, чеммедиана возраста в группе сравнения, составившая 27,0 лет (интерквартильная широта — от25,0 до 30,0 лет) (p=0,0002).
Наиболее выраженные различия между пациентками с гестозом иженщинами без осложнений беременности наблюдались в возрастных группах 25-29 и 35-39лет (таблица 9).Таблица 9 - Возрастная характеристика исследуемых группВозрастнойинтервал (годы)Группа пациенток с гестозом,n=157Группа сравнения,n=99pn%n%15-19620,49080,83,86,8-0,82,04,820-2422220,1258,614,019,414,022,230,425-2945440,010821,628,735,834,744,554,330-3445260,774621,628,735,817,626,335,035-393119,744,00,000313,525,,90,17,945-4985,111,00,15971,78,5-1,03,0Примечания1 Жирным шрифтом выделены статистически значимые различия (p<0,05).2 Слева и справа от значений частот в виде подстрочных индексов указаныграницы 95 % ДИ.В интервале 25-29 лет доля пациенток с гестозом (28,7%) была ниже, чем в группеженщин без патологий беременности (44,5%) (p=0,0108, ОШ=0,50, 95%ДИ:0,30-0,85).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
