Диссертация (1145983), страница 13
Текст из файла (страница 13)
об/мин. Полученныйосадок подсушивали и растворяли в 50-150 мкл буфера ТЕ (10 мМ Трис-HCl pH 7.5, 1 мМЭДТА) ("Serva", Германия) или ампулированной воды. Концентрацию и чистоту ДНКопределяли с помощью спектрофотометра (NanoDrop 2000, "Thermo Fisher Scientific Inc.",США). Раствор ДНК хранили при температуре -200С.Выделение малых РНК из плацентарной ткани. Выделение малых РНК проводили спомощью набора "PureLink miRNA Isolation Kit" ("Thermo Fisher Scientific Inc.", США) согласнопротоколу. Для этого исследуемый образец (не более 10 мг) гомогенизировали в 300 мкллизирующего буфера "L3". Полученный лизат центрифугировали 5 минут при 14000 об/мин.Отбирали супернатант и добавляли к нему равный объем 70% этанола (300 мкл), далееполученный раствор (600 мкл) перемешивали с помощью вортекса и наносили на колонку("Spin Cartridge"). Колонку помещали в пробирку и проводили центрифугирование 1 минутупри 14000 тыс. об/мин.
К собранному в пробирке раствору добавляли 95% этанол ("Химзаказ",Россия) до конечной концентрации 70% (700 мкл). Эту смесь перемешивали с помощьювортекса, наносили на новую колонку (650 мкл) и центрифугировали 1 минуту при 14000 тыс.об/мин. Далее удаляли жидкость из пробирки и повторяли процедуру. Затем на колонкунаносили 500 мкл буфера для отмывки "W5", проводили центрифугирование 1 минуту при14000 тыс. об/мин, удаляли жидкость из пробирки и повторяли отмывку еще раз. Колонкупереносили в новую пробирку и центрифугировали 1 минуту при 14000 тыс. об/мин с цельюполного удаления буфера "W5".
РНК элюировали 40 мкл деионизованной воды, свободной отРНКаз. Раствор РНК хранили при -70оС до приготовления библиотек. Концентрацию РНКопределяли на флуориметре "Qubit 2.0" ("Invitrogen", США) с набором RNA BR Assay Kit("Thermo Fisher Scientific Inc.", США). Качество РНК оценивали с помощью системыкапиллярного электрофореза "2200 TapeStation Instrument" ("Agilent technologies", США),используя чипы "RNA ScreenTape" и реактивы "RNA ScreenTape Sample Buffer", "RNAScreenTape Ladder" ("Agilent technologies", США).2.3 Анализ полиморфных сайтов генов с помощью гибридизации на ДНКбиочипеДляанализаобразцовДНКиспользовалибиочип,позволяющийисследоватьполиморфные сайты генов регуляции АД "Кардио-биочип", созданный в Институтемолекулярной биологии им.
В.А. Энгельгардта РАН совместно с ФГБНУ “НИИ АГиР им.47Д.О.Отта” [Глотов, 2005]. Также нами был разработан "Фибр-биочип" для тестированияпоследовательностей генов системы свертывания крови [Вашукова и др., 2008; Вашукова и др.,2011].Анализ полиморфных сайтов генов регуляции АД с помощью "Кардио-биочипа"."Кардио-биочип" использовали для анализа полиморфных сайтов генов REN rs2368564, AGTrs699, AGTR1 rs5186, AGTR2 rs11091046, BKR2 rs1799722, ADRB2 rs1042713 и rs1042714,MTHFR rs1801133. Анализ образцов ДНК пациенток с гестозом и женщин группы сравнения спомощью "Кардио-биочипа" проводили в соответствии с инструкцией к набору ("БиочипИМБ",Россия).Продуктыамплификации,полученныеспомощьюдвухэтапноймультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР), гибридизировали с иммобилизованнымина микрочипе олигонуклеотидными зондами.Первый этап мультиплексной ПЦР.
На первом этапе ПЦР получали специфическиепродукты амплификации с участков ДНК, содержащих интересуемые полиморфные сайты.Амплификационная смесь (25 мкл) включала Taq-буфер (30 мМ Трис-HCl (рН 8,6), 16,6 мМ(NH4)2SO4,) ("Силекс", Россия), 1,5 мМ MgCl2 ("Силекс", Россия), по 0,2 ммоль каждого издезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дезоксиATФ, -ГТФ, -ЦТФ, -ТТФ) ("Силекс", Россия), 2мкл смеси оригинальных праймеров [Глотов, 2005], 2,5 ед. акт. Taq-полимеразы ("Силекс",Россия), не менее 10 нг ДНК. ПЦР проводили при следующих условиях: денатурация при 95ºСв течение 5 минут; далее 35 циклов по схеме: 95ºС - 30 секунд, 60ºС - 30 секунд, 72ºС - 1минута; затем 72ºС в течение 5 минут.Второй раунд мультиплексной ПЦР. Второй этап применяли для полученияфлуоресцентно меченного одноцепочечного ПЦР-продукта. Состав реакционной смеси (25 мкл)был таким же, как описано предыдущем пункте.
Только в нее, в отличие от смеси для первогоэтапа, добавляли меченные цианиновым красителем дезоксиуридинтрифосфаты (Cy5-dUTP,("Биочип-ИМБ", Россия)) до конечной концентрации 16 пМ/мкл и 2 мкл смеси оригинальныхпраймеров для второго раунда [Глотов, 2005]. В качестве матрицы использовали амплификатпервого этапа ПЦР (1-2 мкл). Амплификацию проводили при следующих условиях:денатурация при 94°С в течение 5 минут, далее 35 циклов по схеме: 94°С - 30 секунд, 62°С - 30секунд, 72°С - 1 минута; затем 72°С, 5 минут.Гибридизация продуктов ПЦР с биочипом. ПЦР-продукты второго этапа наносили набиочип.
Для этого готовили 40 мкл гибридизационной смеси (10 мкл формамид (“Serva”,Германия), 10 мкл 20х SSPE (“Promega”, США) и 20 мкл амплификат), которую денатурировалипри 95°С в течение 5 минут и охлаждали на льду (2-3 минуты). Далее смесь наносили на биочипи оставляли на ночь при 37 °С. После инкубации гибридизационную смесь удаляли, а биочипотмывали в 1xSSPE в течение 10-15 минут при комнатной температуре и высушивали.48Визуализацияфлуоресцентногорезультатовмикроскопаиммобилизованныхнагибридизации.("Биочип-ИМБ","Кардио-биочипе"БиочипыанализировалиРоссия).олигонуклеотидовсСхемапомощьюрасположенияипримеррезультатовгибридизации представлены на рисунке 6.А12345678REN GAGT TAGTR1 AAGTR2 CBKR2 TMTHFR CADRB2 AADRB2 CREN GAGT TAGTR1 AAGTR2 CBKR2 TMTHFR CADRB2 AADRB2 CREN AAGT CAGTR1 CAGTR2 ABKR2 CMTHFR TADRB2 GADRB2 GREN AAGT CAGTR1 CAGTR2 ABKR2 CMTHFR TADRB2 GADRB2 GБГенотип:REN (GG)AGT ( TC)AGTR1 (AA)AGTR2 (CC)BKR2 (TC)MTHFR (CT)ABRB2 (AA и С/C)Рисунок 6 - Схема "Кардио-биочипа" и пример гибридизационной картины [Глотов, 2005]А — расположение зондов в гелевых ячейках биочипа (указаны гены и аллели исследуемыхполиморфных сайтов, все зонды продублированы); Б — пример гибридизационной картины сгенотипом образца.Анализ полиморфных сайтов генов системы свертывания крови с помощью"Фибр-биочипа".
Для исследования полиморфных сайтов генов F5 rs6025, F2 rs1799963, FGBrs1800790, ITGB3 rs5918, PAI1 rs1799768 и MTHFR rs1801133 был разработан "Фибр-биочип"[Вашукова и др., 2008; Вашукова и др., 2011].Приразработке"Фибр-биочипа"использовалиалгоритмсозданиябиочипов,предложенный в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН совместно сФГБНУ “НИИ АГиР им. Д.О. Отта” [Глотов, 2005].
Подбор праймеров для проведения двухэтапов ПЦР и выбор зондов для последующей иммобилизации в гелевые ячейки микрочипапроводили в соответствии с критериями, которые были разработаны ранее [Глотов, 2005]. Впроцессе создания биочипа были оптимизированы условия проведения мультиплексной ПЦРпервого и второго раунда.Подбор олигонуклеотидных праймеров и выбор олигонуклеотидных зондов.
Поискнуклеотидныхпоследовательностейфрагментовгенов,включающихинтересуемыеполиморфные сайты, осуществляли в базах Nucleotide (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/) и49Ensembl(http://www.ensembl.org).Затемвыбиралипоследовательностизондовдляиммобилизации в гелевые ячейки микрочипа (таблица 6).Таблица 6 - Последовательности олигонуклеотидов для иммобилизации в гелевыеячейки микрочипаГенrsНуклеотиднаязамена (делеция)Структура зондовG: 5’-GGACAGGCGAGGAATAC-3’A: 5’-GGACAGGCАAGGAATAC-3’G: 5’-TCTCAGCGAGCCTCAAT-3’F2rs179996320210G>AA: 5’-CTCTCAGCAAGCCTCAA-3’G: 5’-GATTTTAATGGCCCCTTTTG-3’FGBrs1800790-455 G>AA: 5’-GATTTTAATAGCCCCTTTTG-3’5G: 5’- ACACGTGGGGAGTCAG-3’PAI1rs1799768–675 5G>4G4G: 5’-ACACGTGGGGAGTCAG-3’T: 5’- CCTGCCTCCGGGCTCA-3’ITGB3rs59181565Т>СC: 5’- CCTGCCTCTGGGCTCA-3’C: 5’-TGCGGGAGCCGATTTCA-3’MTHFRrs1801133677С>ТT: 5’-TGCGGGAGTCGATTTCA-3’Примечание- rs - идентификационный номер полиморфного сайта в международнойбазе NCBI dbSNP [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/].F5rs60251691G>AПраймеры для ПЦР подбирали с помощью программы Oligo v.6.31 (Molecular BiologyInsights,США).СпецифичностьоценивалиспомощьюпрограммыBLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast).
Последовательности праймеров, выбранных для проведенияпервого и второго раундов ПЦР, представлены в таблице 7.Синтез олигонуклеотидов и изготовление "Фибр-биочипов". Олигонуклеотиды дляиммобилизации в гелевые ячейки биочипа синтезировали, как описано ранее [Глотов, 2005].Биочипы изготавливали согласно технологии, разработанной в Институте молекулярнойбиологии им. В.А. Энгельгардта РАН ("Биочип-ИМБ", Россия) [Глотов, 2005].Подбор условий и проведение мультиплексной ПЦР первого раунда. МультиплекснуюПЦР первого раунда проводили, как описано в п.
2.3.1., используя 2 мкл смеси праймеров дляанализа полиморфных сайтов генов F5, F2, FGB, ITGB3, PAI1 и MTHFR ("Биочип-ИМБ",Россия). В процессе оптимизации условий реакции были подобраны следующие концентрациипраймеров: для амплификации фрагментов генов F5, FGB, F2, ITGB3 – по 0,4 пМ прямого иобратного праймеров, для MTHFR – по 0.2 пМ и для PAI1 – по 0,8 пМ каждого из парыпраймеров.
Также был подобран оптимальный режим проведения ПЦР: денатурация при 95°С втечение 5 минут, далее 35 циклов по схеме: 95°С - 30 секунд, 60°С - 30 секунд, 72°С - 1 минута;затем 72°С - 5 минут. Анализ результатов амплификации проводили с помощьюэлектрофоретического разделения ПЦР-продуктов в полиакриламидном геле (ПААГ) (п. 2.5).Подбор условий и проведение мультиплексной ПЦР второго раунда. МультиплекснуюПЦР второго раунда проводили, как описано в п.
2.3.1., используя 2 мкл смеси праймеров дляанализа полиморфных сайтов генов F5, F2, FGB, ITGB3, PAI1 и MTHFR ("Биочип-ИМБ",50Россия). В процессе оптимизации условий реакции для получения необходимого количестваодноцепочечного продукта, было подобрано оптимальное соотношение концентраций прямыхи обратных праймеров, для каждого из шести амплифицируемых фрагментов оно составило1:50 (по 0,04 пМ и 2 пМ каждого из прямых и обратных праймеров). Также были подобраныоптимальное количество ПЦР-продукта первого этапа (2 мкл) и режим проведения ПЦР:денатурация при 95°С в течение 5 минут, далее 35 циклов по схеме: 95°С - 30 секунд, 62°С - 30секунд, 72°С - 1 минута; затем 72°С - 5 минут.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
