Диссертация (1145983), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Эффективность амплификации оценивали погибридизации продуктов ПЦР с биочипом.Таблица 7 - Нуклеотидные последовательности праймеров для проведения первого ивторого раундов ПЦР [из статьи Вашуковой и др., 2011]ГенrsНуклеотиднаязамена (делеция)Структура олигопраймеров1 раунд ПЦРF: 5’-TCAGGCAGGAACAACACCATGATCA-3’F5rs60251691G>AR: 5’-CCTTCGGCAGTGATGGTACTG-3’F: 5’-GATGTGACCTTGAACTTGACTCTATTG-3’F2rs1799963 20210G>AR: 5’-GAGTGCTCGGACTACCAGCGT-3’F: 5’-CAGCACAAAAAAAGGGTCTTTCTGATGTG-3’FGBrs1800790 -455 G>AR: 5’-CCTCAAAGAGAGATGTGTATCTTGTTTCTG-3’F: 5’-TGGTCCCGTTCAGCCACC-3’PAI1rs1799768 –675 5G>4GR: 5’-CGTGATTGTCTAGGTTTTGTCTGTCTAGG-3’F: 5’-GGAGGTAGAGAGTCGCCATAG-3’ITGB3rs59181565Т>СR: 5’-GACTGACTTGAGTGACCTGGG-3’F: 5’-CCAGTCCCTGTGGTCTCTTCAT-3’MTHFRrs1801133 677С>ТR: 5’-AGGGAGCTTATGGGCTCTCCT-3’2 раунд ПЦРF: 5’-CCATACTACAGTGACGTGGACATCATG-3’F5rs60251691G>AR: 5’-CCCCATTATTTAGCCAGGAGACCTAAC-3’F: 5’-GAAGTGGATACAGAAGGTCATTGATCAGT-3’F2rs1799963 20210G>AR: 5’-GCACCAGGTGGTGGATTCTTAAGTCTT-3’F: 5’-GGTCTTTCTGATGTGTATTTTTCATAGAATAGGG-3’FGBrs1800790 -455 G>AR: 5’-GTGGAAACTACACAAGCTCCGAAAGAATA-3’F: 5’-GTTGTTGACACAAGAGAGCCCTCAG-3’PAI1rs1799768 –675 5G>4GR: 5’-CGTGATTGTCTAGGTTTTGTCTGTCTAGG-3’F: 5’-GGAGGTAGAGAGTCGCCATAG-3’ITGB3rs59181565Т>СR: 5’-GCACAGTTATCCTTCAGCAGATTCTC-3’F: 5’-TACCCCAAAGGCCACCCCGAAGCA-3’MTHFRrs1801133 677С>ТR: 5’-ATGTCGGTGCATGCCTTCACAAAGCG-3’Примечание - rs - идентификационный номер полиморфного сайта в международной базе NCBI dbSNP[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/].Гибридизация продуктов ПЦР с биочипом.
Гибридизацию на биочипе проводили, какописано в п. 2.3.1.Визуализация результатов гибридизации. Анализ результатов гибридизации проводили,как описано в п. 2.3.1. Схема расположения иммобилизованных на "Фибр-биочипе"олигонуклеотидов и пример результатов гибридизации представлены на рисунке 7.51А1F5 GF5 GF5 AF5 A2FGB GFGB GFGB AFGB A3F2 GF2 GF2 AF2 A4ITGB3 ТITGB3 ТITGB3 СITGB3 С5PAI1 5GPAI1 5GPAI1 4GPAI1 4G6MTHFR CMTHFR CMTHFR TMTHFR TБГенотип:F5 (GG)FGB (GG)F2 (GG)ITGB3 (TC)PAI1 (4G4G)MTHFR (CT)Рисунок 7 - Схема "Фибр-биочипа" и картина гибридизации [из статьи Вашуковойи др., 2008 с изменениями]А — расположение зондов в гелевых ячейках биочипа (указаны гены и аллели исследуемыхполиморфных сайтов, все зонды продублированы); Б — пример гибридизационной картины сгенотипом образцаАпробация биочипа. Для верификации результатов гибридизации проводили сравнениерезультатов гибридизации с использованием "Фибр-биочипа" и типирования исследованныхобразцов ДНК с помощью ПЦР-ПДРФ-анализа (анализ полиморфизма длины рестрикционныхфрагментов, п.
2.4). Были протестированы 100 образцов, несовпадение результатовгенотипирования было обнаружено в 1 случае из 600 определенных генотипов, таким образом,специфичность гибридизации на "Фибр-биочипе" составила 99,83%. Чувствительностьоценивали методом последовательных разведений геномной ДНК (0,1-1000 нг).
Минимальноеколичество ДНК, позволяющее однозначно определять генотип, составило 10 нг.2.4 Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФметод)Метод ПЦР-ПДРФ использовали для исследования полиморфных сайтов генов F7rs6046, ITGA2 rs1126643, NOS3 rs1800779, LPL rs328, CETP rs3764261, APOA1 rs4938303,SCARB1 rs5888 и NR1H2 rs2695121, а также для верификации результатов анализа образцовДНК с помощью "Фибр-биочипа".52Подборолигонуклеотидныхнуклеотидныхпоследовательностейпраймеровфрагментовиэндонуклеазгенов,рестрикции.содержащихПоискинтересуемыеполиморфные сайты, осуществляли, как описано в п. 2.3.2.
Затем выбирали эндонуклеазырестрикции. Праймеры для ПЦР подбирали с использованием программ Oligo v.6.31 (MolecularBiology Insights, США) и BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast). Последовательности праймеров,размеры ПЦР-продуктов, названия эндонуклеаз рестрикции и длины продуктов расщепленияпредставлены в таблице 8.Проведение ПЦР. Для всех маркеров реакционная смесь для ПЦР (25 мкл) содержалаTaq-буфер (30 мМ Трис-HCl (рН 8,6), 16,6 мМ (NH4)2SO4,) ("Силекс", Россия), 1,5 мМ MgCl2("Силекс", Россия), по 0,2 ммоль каждого из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дезоксиATФ,-ГТФ, -ЦТФ, -ТТФ) ("Силекс", Россия), по 0,4 пМ соответствующих прямого и обратногопраймеров ("Синтол", Россия), 2,5 ед.
акт. Taq-полимеразы ("Силекс", Россия), не менее 5 нгДНК. Реакцию проводили при следующих условиях: денатурация при 95ºС в течение 5 минут;далее 35 циклов по схеме: 95ºС - 30 секунд, 60ºС - 30 секунд, 72ºС - 1 минута; затем 72ºС втечение 5 минут. Специфичность амплификации и количество продуктов ПЦР оценивали спомощью электрофореза в ПААГ (п. 2.5).Обработка ПЦР-продуктов эндонуклеазами рестрикции. Реакцию ферментативногогидролиза амплифицированных фрагментов ДНК проводили в условиях, рекомендуемыхпроизводителем ("Cибэнзим", Новосибирск; MBI "Fermentas", Литва). Для этого ПЦР-продукты(2-5 мкл) обрабатывали специфическими эндонуклеазами рестрикции (5-10 ед.) в присутствии1Х буфера, рекомендованного производителем, и инкубировали ночь при соответствующейтемпературе.
Результаты гидролиза оценивали с помощью электрофореза в ПААГ (п.2.5).2.5 Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ)Фрагменты ДНК после амплификации и/или рестрикции разделяли в 8%-ом ПААГ(акриламид: бис-акриламид 19:1) ("Invitrogen", США) в присутствии трис-боратного буфера (89мМ Трис, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА, рН=8,0) ("Serva", Германия). Перед нанесениемна электрофорез в пробы добавляли буфер, содержащий 0,25% бромфенолового синего("Invitrogen", США), 0,25% ксиленцианола ("Invitrogen", США) и 15% фикола ("Invitrogen",США). ПААГ окрашивали в растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) ("Sigma", США) ианализировали в ультрафиолете при длине волны 302 нм ("Macrovue", "Pharmacia LKB",Великобритания).53Таблица 8 - Олигонуклеотидные праймеры и эндонуклеазы рестрикции, использованные в работеГенrsНуклеотиднаязамена (делеция)Размер ПЦРпродуктаФерментF7rs604610976G>AF: 5’- CTACTCGGATGGCAGCAAGG-3’R: 5’- CAGGACAGTTCGACGCAGC-3’282 п.о.Msp IАллель G - 218 и 64 п.о.Аллель A - 282 п.о.F5rs60251691G>AF:5’–АСАTCGCCTCTGGGCTAATA–3’R: 5’–TTGAAGGAAATGCCCCATTA–3’152 п.о.Mnl IАллель G - 115, 37 и 17 п.о.Аллель A - 152 и 17 п.о.F2rs179996320210G>AF:5’–GTTGCCTGGCAGGGGAATACT–3’R:5’–GAATAGCACTGGGAGCATTGAAGC–3’337 п.о.Hind IIIАллель G-337 п.о.Аллель A-312 и 25 п.о.FGBrs1800790-455 G>AF:5’–CAGCACAAAAAAAGGGTCTTTCTGATGTG–3’R:5’–GTGGAAACTACACAAGCTCCGAAAGAATA–3’295 п.о.Hae IIIАллель G-160 и 135 п.о.Аллель A-295 п.о.ITGB3rs59181565Т>С123 п.о.Msp IITGA2rs1126643807C>Т286 п.о.Taq IPAI1rs1799768–675 5G>4G133 п.о.Bsc4 INOS3rs1800779-786T>CF: 5’- CTGTGGACCAGATGCCCAG-3’R: 5’- GTCATTCAGTGACGCACGCTC -3’230 п.о.Msp IАллель T - 230 и 25 п.о.Аллель C -184, 46 и 25 п.о.MTHFRrs1801133677С>ТF: 5’-CCAGTCCCTGTGGTCTCTTCAT-3’R: 5’-AGGGAGCTTATGGGCTCTCCT-3’304 п.о.HinF IАллель C - 304 п.о.Аллель T - 154 и 150 п.о.LPLrs3281595С>GF:5’- GCCATGACAAGTCTCTGAATAAGGAG-3’R:5’- GATCACATGAGTCAGGGCAAGC-3’167 п.о.Hinf IАллель C - 143 и 24 п.о.Аллель G - 167 п.о.SCARB1rs58881050C>TF 5`-TCTCCCATCCTCACTTCCTCAAAG-3`R 5`-AGAGAGGAGGCAGCCAGGTGT-3`186 п.о.Alu IАллель C - 186 п.о.Аллель T - 165 и 21 п.о.APOA1rs4938303501C>AF: 5`-GGCTTGGTAAGGGTAGTAGGGT-3`R: 5`-GATAGGGCATCTGTTGCATATAGACA-3`212 п.о.Mbo IIАллель A - 119 и 93 п.оАллель G - 212 п.оNR1H2rs2695121-103T>CF: 5`-GCTTAAGACCAAGCTGAAGGCTG-3`R: 5`-CAGGGAACTCGTGGTAGGAGA-3`261 п.о.Bso 31IАллель T - 261 п.оАллель C - 147 и 114 п.оCETPrs37642612490C>AF: 5`-GTGAGAGAGGGTGAGCTTCCATGA-3`R: 5`-CTTCACCTGTCGGTAGGCAGCT-3`136 п.о.Gsa IАллель C - 115 и 21 п.оАллель A - 136 п.оСтруктура олигопраймеровF: 5’- GGAGGTAGAGAGTCGCCATAG-3’R:5’– GCACAGTTATCCTTCAGCAGATTCTC –3’F: 5’- GGAAGTGATGCCTTAAAGCTACCG-3’R: 5’-CACCAAAACTTACCTTGCATATTGAATTGCTT-3’F: 5’-CAGAGAGAGTCTGGСCACGT-3’R:5’–CGTGATTGTCTAGGTTTTGTCTGTCTAGG –3’Примечания1 п.о.
- пар оснований.2 rs - идентификационный номер полиморфного сайта в международной базе NCBI dbSNP [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/].Размер фрагментов рестрикцииАллель T - 91 и 32 п.о.Аллель C - 72, 19 и 32 п.о.Аллель C - 252 и 34 п.о.Аллель T - 286 п.о.Аллель 5G - 73, 19 и 41 п.о.Аллель 4G - 92 и 41 п.о.542.6 Анализ образцов малых РНК на секвенаторе "Ion Torrent"Подготовка библиотек кДНК-копий малых РНК. Подготовку библиотек кДНК-копиймалых РНК проводили по протоколу набора "Ion Total RNA-Seq Kit v2" ("Thermo FisherScientific Inc.", США). На первом этапе фрагменты малых РНК (70-100 ng) лигировали садаптерами "Ion Adaptors". Для этого на льду к каждому образцу РНК (3 мкл) добавляли 5 мклсмеси для гибридизации (2 мкл смеси адаптеров "Ion Adaptor Mix v2" и 3 мкл раствора длягибридизации).
Смесь нагревали до 65°C 10 минут, затем охлаждали до 16°C в течение 5 минут.К ней добавляли 10 мкл 2х буфера для лигирования и 2 мкл раствора лигазы "Ligation EnzymeMix" и оставляли на ночь при 16°C. Затем проводили реакцию обратной транскрипции. На льдук продуктам лигирования (20 мкл) добавляли 16 мкл смеси для обратной транскрипции (2 мклводы, свободной от РНКаз, 4 мкл 10х буфера для обратной транскрипции, 2 мкл 2,5 мМ смесииз dNTP, 8 мкл раствора праймеров "Ion RT Primer v2").
Смесь нагревали до 70°С 5 минут,затем охлаждали на льду 1 минуту и добавляли к ней 4 мкл раствора ревертазы "10XSuperScript®III Enzyme Mix". После чего проводили инкубацию 1 час при 37°С. ПолученнуюкДНК очищали при помощи магнитных частиц, используя "Magnetic Bead Cleanup Module".ДНК с поверхности частиц элюировали стерильной водой (12 мкл), предварительно нагретой дотемпературы 37°С.
6 мкл очищенной кДНК использовали в качестве матрицы для последующейамплификации. Готовили смесь, включающую раствор кДНК, 45 мкл смеси для проведенияПЦР "Platinum PCR SuperMix High Fidelity reaction mix" и по 1 мкл растворов праймеров "Ion 5PCR Primer v2" и "Ion 3 PCR Primer v2". Реакцию проводили согласно протоколу.Амплифицированные фрагменты ДНК очищали, используя "Magnetic Bead Cleanup Module".ДНК с поверхности магнитных частиц элюировали 15 мкл стерильной воды. Качество иконцентрацию полученных библиотек оценивали с помощью системы "2200 TapeStationInstrument" ("Agilent technologies", США), используя чипы "High Sensitivity D1K ScreenTape" иреактивы "High Sensitivity D1K Reagents" ("Agilent technologies", США).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
