Диссертация (1145742), страница 23
Текст из файла (страница 23)
В центральной части этих последовательностей закодированконсервативный PAZ-домен, ближе к С-концу – Piwi-домен (Рис. 37). Филогенетическийанализ выявил разделение белковых последовательностейPiwi большинствамногоклеточных животных на два подсемейства – Piwi-1-подобное и Piwi-2-подобное,особняком стоят лишь гены Aubergine и Piwi дрозофилы. (Рис. 38).
В обоихподсемействах встречаются гомологи Piwi одних и тех же организмов, за исключениемединственного гена Piwi актинии Nematostella, вошедшего в нашем анализе в111подсемейство Piwi-1. Это обстоятельство, скорее всего, указывает на древнеепроисхождение Piwi-1-подобного и Piwi-2-подобного паралога еще у общего предкаBilateria.
Соответствующие паралоги были унаследованы в геноме A. virens и другихспиралий (Capitella, Crassostrea), чьи последовательности группируются как в кластереPiwi-1, так и в кластере Piwi-2. Единственный известный для P. dumerilii ген Piwi(Rebscher et al., 2007) формирует общую ветвь с Avi-piwi1. Относительно небольшаядлина ветвей, ведущих к последовательностям Avi-piwi1 и Avi-piwi2, говорит обумеренной скорости их дивергенции.Рис. 37.
Строение предполагаемых белковых продуктов Piwi у A. virens. Фиолетовымиблоками выделены консервативные домены PAZ и Piwi. Цифрами обозначена длинапоследовательности в аминокислотных остатках.Рис. 38. Филогенетическое древо аминокислотных последовательностей Piwi по методумаксимального правдоподобия (Maximum likelihood). Для каждой последовательностиприведен буквенно-цифровой код из базы NCBI. Оценка статистической достоверностиузла на основе aLRT обозначена цифрами. Шкала в количестве замен на позицию.Выявленные с помощью гибридизации in situ пространственные паттерныэкспрессии Avi-piwi1 и Avi-piwi2 в целом проявляют большую степень сходства.
Однакомаксимальный дифференциальный сигнал мРНК Avi-piwi1 на всех проанализированныхстадиях является более интенсивным, чем таковой у Avi-piwi2, что можетсвидетельствовать о различиях в уровне экспрессии этих генов.112Как и в случае Avi-vasa и Avi-pl10 различная по интенсивности в разных зачаткахэкспрессия паралогов Piwi устанавливается к стадии ранней трохофоры. С этогомомента и до стадии ранней метатрохофоры экспрессия выявляется в большинствезачатков личинки. Относительно невысокуровень экспрессии генов Piwi вэктодермальных производных – покровном эпителии всей гипосферы, примыкающих кпрототроху участках эписферы, нейроэктодерме, хетоносных мешках и стомодеуме(Рис. 39).
Гораздо большую яркость сигнал имеет во внутренних (мезодермальных)структурах. Avi-piwi1 проявляет практически идентичный с Avi-vasa и Avi-pl10 паттернэкспрессии в эктомезодерме. У ранних трохофор в составе эктомезодермы хорошоотличимы крупные боковые Avi-piwi1-положительные клетки и скопление болеемелких ростральных клеток, расположенных над стомодеальной пластинкой (Рис. 39А). У более зрелых личинок формируется сплошной домен экспрессии Avi-piwi1 вокругстомодеума (Рис. 39 Д, И).Рис. 39.
Экспрессия Avi-piwi1 (А–В, Д–Ж, И–Л) и Avi-piwi2 (Г, З, М) в начале ларвальногоразвития. Гибридизация in situ, DIC. А–Г – ранняя трохофора (43 чпо); Д–З – средняятрохофора (59 чпо); И–М – ранняя метатрохофора (90 чпо). А, Д, И – вентральнаяпроекция; Б, Г, Е, З, К, М – вентральная проекция, глубокая фокальная плоскость; В, Ж,113Л – латеральная проекция, дорсальная сторона справа.
Энтомезодерма(мезодермальные полоски) отмечена оранжевым пунктиром, экспрессия в нихпоказана белыми стрелками, экспрессия в основании МП (во вторичном мезобласте) –прозрачным треугольником, экспрессия в эктомезодерме – оранжевымитреугольниками, экспрессия в эктодерме – синими треугольниками, Х – вегетативныйполюс (область проктодеума), звездочка – область стомодеума. Масштаб 25 мкм.В пределах энтомезодермы трохофор для транскриптов Avi-piwi2 характерноболее или менее равномерное распределение по длине МП (Рис. 39 Г, З). В случае жеAvi-piwi1 можно говорить о преобладании экспрессии на переднем конце МП стенденцией к ослаблению ее интенсивности в задних частях МП (Рис. 39 Б, В, Е, Ж).
Настадии ранней метатрохофоры относительно сильная экспрессия паралогов Piwiприурочена к внутренним тканям по бокам гипосферы (Рис. 39 К–М). Расположениенекоторых Avi-piwi1-положительных клеток вокруг хетоносных мешков практическиполностью повторяет паттерн экспрессии Avi-twist в предполагаемых зачаткахпараподиальных мышц.Так же как и в случае Avi-vasa один из наиболее сильных внутренних доменовэкспрессии Avi-piwi1 находится на вегетативном полюсе (Рис. 39 Б, Е, К). У трохофорныхличинок этот домен включает около 6–8 мелких клеток, а у метатрохофор он сильнорасширяется в поперечном направлении. Тканевую принадлежность этого доменаавтор связывает с вторичным мезобластом (особыми клетками, происходящими отмезотелобластов).3.2.Разработкагенетическихметодовприжизненногоифункционального анализаВажнейшим подходом к объяснению причинности феноменов развитияявляются экспериментальные методы.
Высокоточные генетические манипуляциидоступны в данный момент лишь для ограниченного числа модельных объектов. Длявключения в их список нереидных полихет были предприняты исследованияметодическойнаправленности.Онипозволилиполучитькачественноновыйинструмент для анализа развития мезодермы у Spiralia.3.2.1.
Трансгенез на основе транспозона Mos1Трансгенез с использованием ДНК-транспозонов был впервые опробован на P.dumerilii К. Тессмар, Ф. Райбле и Б. Бэкфишем. Трансгены на основе транспозонов Tol2114и Minos показали относительно высокую эффективность работы в поколении G0, но вследующих поколениях экспрессия трансгена прекращалась (Backfisch, 2013). Спомощью генетической репортерной конструкции на основе транспозона Mos1 былиполучены первые стабильные трансгенные линии P. dumerilii (Backfisch et al., 2013;Backfisch et al., 2014). Однако для более широкого применения подобных трансгенныхконструкций требовалось дополнительно проанализировать механизм транспозиции,т.е. параметры вырезания и встраивания транспозона Mos1 в геном P.
dumerilii, что ибыло сделано в нашей работе.Рис. 40. Вырезание трансгена на основе транспозона Mos1 из вектора в зависимости отналичия транспозазы. А – строение трансгена, цифрами обозначена длинапоследовательности в bp. На границах трансгена расположены терминальные повторы(Mos1 TR, красные блоки), оканчивающиеся 3’ и 5’ инвертированными повторами (ITR).Трансген кодирует флуоресцентные маркеры dsRed и GFP (оливковые блоки) ипромоторную область гена Pdu-rps9 (циановый). Б – строение вектора-донора до ипосле вырезания трансгена.
Черные стрелки показывают положение праймеров дляскрининга. В – результаты гнездовой ПЦР на зародышах, инъецированных вектором с(+ mos1) или без (– mos1) мРНК транспозазы. М – дорожка с маркером молекулярноговеса 2-Log (NEB), цифрами слева обозначена длина фрагментов ДНК в bp.Параметрывырезаниятранспозонаизвектора-донораиактивностьвспомогательного фермента – транспозазы Mos1 – анализировали с помощью ПЦР. Дляэтого в зиготы P.
dumerilii инъецировали ДНК вектора-донора pMos{rps9::egfp}frkt1074 сили без мРНК транспозазы. Через четыре часа после микроинъекций зародышейиспользовали в ПЦР с праймерами, комплементарными к последовательности вектораза пределами трансгена (Рис. 40 А, Б). Праймеры были подобраны так, чтобы вотсутствие транспозона (с “пустого” вектора) в ПЦР амплифицировался фрагментдлиной 388 bp. Из зародышей, инъецированных смесью с мРНК транспозазы Mos1,115были получены ампликоны различной длины – от 100 до 552 bp (Рис. 40 В). В случаеинъекций смесью без мРНК Mos1 продукт ПЦР отсутствовал. Этот факт подтвердилотсутствие эндогенной активности Mos1 у P.
dumerilii. В случае доставки экзогенноймРНК Mos1 можно с уверенностью говорить об успешной выработке в клетках P.dumerilii активного фермента. Варьирующая длина ампликонов, по-видимому, связанас вариабельностью места вырезания транспозона из вектора-донора.Полученныеампликоныбыликлонированыипросеквенированы.Ихвыравнивание с последовательностью вектора (Рис. 41) показало, что, действительно,транспозон вырезается неточно, т.е. не по границам терминальных инвертированныхповторов (ITR), как происходит по каноническому механизму у других модельныхобъектов.
Из 21 просеквенированной последовательности в девяти присутствовалифрагменты транспозона, а у остальных 12-ти не хватало фрагментов вектора запределами ITR. Кроме того, в семи ампликонах в области соединения 5’ и 3’ концоввектора были обнаружены невыравниваемые (не соответствующие какой-либо частивектора и транспозона) участки длиной 1–24 bp.Рис. 41.
Выравнивание ампликонов из ПЦР-скрининга и вектора-донораpMos{rps9::egfp}frkt1074.Цифраминаверхуислеваобозначенадлинапоследовательности в bp. Границы точно вырезаемого трансгена показаны синимпунктиром. Сохранившиеся в ампликонах полноразмерные инвертированные повторы(ITR) показаны красными блоками, их фрагменты – оранжевыми, векторная область запределами трансгена – зелеными.Для анализа места интеграции трансгена на основе транспозона Mos1 в геном P.dumerilii использовались трансгенные животные из линий tuba::egfpvbci1 и ropsin::egfpvbci2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
