Диссертация (1145742), страница 18
Текст из файла (страница 18)
16. Строение и принцип работы TALEN. А – позиционирование пары белков TALENна последовательности-мишени за счет ДНК-связывающих доменов. Димеризация82нуклеазных доменов Fokl обеспечивает двунитевой разрыв ДНК в области спейсера. Б –репарация двунитевого разрыва. В отсутствие матрицы для восстановленияпервоначальнойпоследовательностиindel-мутациивозникаютзасчетнегомологичного воссоединения концов (NHEJ) – синяя стрелка. При наличии ДНКдонора теоретически возможна репарация по типу гомологической рекомбинации –красная стрелка.Дизайн TALEN подбирался с помощью on-line сервиса TALEN Targeter(https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen), куда загружали 5’ область первогоэкзона Pdu-twist до начала последовательности, кодирующей bHLH домен. Пары TALENвыбирали из предложенного списка с тем, чтобы их длина составляла от 12 до 20 ДНКсвязывающих доменов, эти домены содержали как можно больше RVD HD,распознающих цитозин, и как можно меньше – RVD NN, связывающий гуанин.Отвергались сайты TALEN, заходящие на выявленные SNP.
Cпейсерная область должнабыла содержать сайт рестрикции, разделяющий ампликон 483 bp для генотипирования(см. выше) на отличимые фрагменты при скрининге мутаций. Подобранные TALEN(картированы на Рис. 49) имели следующие последовательности RVD:twi-1L HD NI NN HD HD NI NN NG NN HD NG HD HD NN NG HD (16 RVD);twi-1R NN HD NI NN NN NN HD NN HD NG HD NI NG NN NN NG (16 RVD);twi-2L HD NI NN NN NI NG NN HD NI NN HD NN NI HD NI NN (16 RVD);twi-2R HD HD NN HD HD NI HD NG NG HD HD NN NG (13 RVD);twi-3L HD NI NN NN NI NG NN HD NI NN HD NN NI HD NI NN HD (17 RVD);twi-3R HD HD NN NI NN NI NG HD HD NN HD HD NI HD NG NG HD (17 RVD).Клонирование этих TALEN из набора плазмид с последовательностямиотдельных RVD производили по опубликованному протоколу (Cermak et al., 2011) изнабора Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 (Addgene).
Конечнымиэкспрессионными векторами, содержащими гетеродимерный FokI служили pCS2TAL3DD и pCS2TAL3-RR (Addgene). Корректность последовательности RVD проверялисеквенированием.Для получения мРНК TALEN плазмиды (2–5 мкг) линеаризовали рестриктазойNotI-HF (NEB), проверяли электрофорезом, вырезали и выделяли из агарозного геля ииспользовали в качестве матрицы для транскрипции in vitro. Синтез РНК ставили на 3 чили на ночь при +37°С, используя набор mMESSAGE mMACHINE Sp6 Kit (Ambion).
РНК невыделяли, а лишь проверяли качество продукта электрофорезом, делали аликвоты и83хранили при -80°С. Конечная концентрация мРНК TALEN в растворе для микроинъекцийсоставляла от 100 до 400 нг/мкл.TAIL-ПЦРПротоколTAIL-ПЦР(ThermalAsymmetricInterlacedPCR)былполученлабораторией Ф. Райбле от Я. Сасакура (Sasakura et al., 2003). TAIL-ПЦР представляетсобой 3 последовательные полугнездовые ПЦР, способные амплифицировать участокДНК лишь с одним заданным концом. К этому концу апликона подбираются 3последовательных (гнездовых) праймера.
Второй конец ампликона лежит в области спервоначально неизвестной последовательностью ДНК. Этот конец определяетсяотжигом одного из вырожденных праймеров:#98 TailN-1 NGTCGASWGANAWGTT#99 TailN-2 GTNCGASWCANAWGTT#100 TailN-3 WGTGNAGWANCANAGA#101 TailN-4 NGTCGASWGANAWCTT#102 TailN-5 GTNCGASWCANAWCAA#103 TailN-6 WGTGNAGWANCANTCT#104 TailN-7 NGTCGASWGANAWAGA#105 TailN-8 WGTGNAGWANCANGTTС каждым вырожденным праймером ставили серию ПЦР со следующимиспецифическими праймерами (…_TAIL1, _TAIL2, _TAIL3):Праймеры в области левого инвертированного повтора транспозона Mos1:#2274 MosL_TAIL1 GGCACGAAACTCGACATGTTGACTGC#2275 MosL_TAIL2 AACAATTATGACGCTCAATTCGCGCC#2276 MosL_TAIL3 GGTGGTTCGACAGTCAAGGTTGACACTTCПраймеры в области вектора-донора за пределами левого инвертированногоповтора транспозона Mos1:#2277 MosL_vec_TAIL1 AAACTGCTCGAAGAACTCCAATCTG#2278 MosL_vec_TAIL2 TGCCTGGTCATTGTTTACATTTAGCTC#2279 MosL_vec_TAIL3 CCATACACACCCATGTGTAGATAAAGПраймеры в области правого инвертированного повтора транспозона Mos1:#2280 MosR_TAIL1 AGCGCTTCGATTCTTACGAAAGTGTG#2281 MosR_TAIL2 GGTTCGCCGCAAAAGACGATGAGTTC#2282 MosR_TAIL3 GGAATCCACAAATTGCCCGAGAGATGG84Праймеры в области вектора-донора за пределами правого инвертированногоповтора транспозона Mos1:#2283 MosR_vec_TAIL1 CACCGACTGGAGCCCGTACTGTG#2284 MosR_vec_TAIL2 CCACGAAAGTGGAAGTGCGCATG#2285 MosR_vec_TAIL3 GGGAACTGCTAGCACGCAGTGПраймеры в области BAC-клона 94H8 у 5’ конца локуса Avi-pl10:#2314 N94H8Nvi-pl10_TAIL1 CTCCCCTACTCCTCCCTCAGAC#2244 N94H8Nvi-pl10_TAIL2 CCACCTCGAATAGAAGCCTTTCAG#2313 N94H8Nvi-pl10_TAIL3 TTCAATTGAGGGAGGGCCTTTATTCПраймеры в области BAC-клона 109A1 у 5’ конца локуса Avi-piwi1:#2315 N109A1Nvi-piwi1_TAIL1 TGGCATCCTGCAATGCCTAATTTTG#2265 N109A1Nvi-piwi1_TAIL2 GGCTGCAGTGGTGGTGTTGGTG#2258 N109A1Nvi-piwi1_TAIL3 GGGACCATGGCAATGAGATGAAGGПраймеры в области BAC-клона 87P17 у 5’ конца локуса Avi-piwi2:#2316 N87P17Nvi-piwi2_TAIL1 GTGGCAAAAGACCTTTACAGTGTGTC#2246 N87P17Nvi-piwi2_TAIL2 TTGGATGTCCTTGGACAGGTAAG#2317 N87P17Nvi-piwi2_TAIL3 CAAACTAGTGCCGTGTTAAGCAATCДля получения последовательности ДНК, граничащей с интегрированным вгеном P.
dumerilii трансгеном на основе транспозона Mos1, из червей линийtuba::egfpvbci1 и r-opsin::egfpvbci2 выделяли гДНК и использовали по 1 образцу на линию в4 сериях ПЦР, каждая из которых имела 8 вариантов (с 8 различными вырожденнымипраймерами). Результат первой реакции разводили 1:25 и добавляли по 1 мкл вовторую (полугнездовую) реакцию, аналогичным образом ставили третью (следующуюполугнездовую) реакцию.ПЦР смесь:ДНК5 µl5х HF буфер (с 7,5 mM MgCl2)4 µldNTPs (10 mM)1 µlгеноспецифичный праймер (5 µМ) 0,8 µlвырожденный праймер (100 µМ) 1 µlPhusion ДНК-полимераза (NEB)0,2 µlH2O8 µlИТОГО20 µl85ПЦР программа (первая реакция): 95°С – 5 мин, 98°C – 30 сек, 94°C – 1 мин, 95°C– 1 мин, (94°C – 1 мин, 65°C – 1 мин, 72°C – 30 сек)х5 циклов, 94°C – 1 мин, 25°C – 3 мин,72°C – 3 мин, (94°C – 30 сек, 64°C – 1 мин, 72°C – 3 мин, 94°C – 30 сек, 64°C – 1 мин, 72°C– 3 мин, 94°C – 30 сек, 44°C – 1 мин, 72°C – 3 мин)х15 циклов, 72°C – 5 мин.ПЦР программа (вторая реакция): 95°С – 5 мин, 98°C – 30 сек, (94°C – 30 сек, 64°C– 1 мин, 72°C – 3 мин, 94°C – 30 сек, 64°C – 1 мин, 72°C – 3 мин, 94°C – 30 сек, 44°C – 1мин, 72°C – 3 мин)х14 циклов, 72°C – 5 мин.ПЦР программа (третья реакция): 95°С – 5 мин, 98°C – 30 сек, (94°C – 30 сек, 64°C– 1 мин, 72°C – 3 мин, 94°C – 30 сек, 64°C – 1 мин, 72°C – 3 мин, 94°C – 30 сек, 44°C – 1мин, 72°C – 3 мин)х12 циклов, 72°C – 5 мин.Для воссоздания последовательности контигов в ВАС-клонах up-stream 5’ концагенов интереса сходным образом осуществляли TAIL-ПЦР на образцах очищенной ВАСДНК.RT-ПЦРС помощью полуколичественной полимеразной цепной реакции с обратнойтранскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR) изучали относительный уровень экспрессии геновPdu-twist, Pdu-mapk, Pdu-mapkk в ходе эмбрионального и ларвального развития P.dumerilii.
По 2–3 эмбриональных культуры от разных родителей промывали через сито,концентрируя в 2 мл пробирке, осаждали центрифугированием, отбирали морскуюводу и замораживали в жидком азоте, а затем хранили при -80°C. мРНК выделяли спомощью RNeasy Mini Kit – Purification of Total RNA from Animal Tissues (Qiagen) попротоколу производителя. Обратную транскрипцию проводили набором QuantiTectReverseTranscriptionHandbook(Qiagen),предусматривающимэлиминациювозможного контаминанта – гДНК. Полученные образцы кДНК разводили в воде 1:1 ииспользовали в ПЦР.ПЦР смесь:ДНК1 µl10х CL буфер (с 15 mM MgCl2)2,5 µldNTPs (10 mM)0,8 µlпраймер прямой(5 µМ)1 µlпраймер обратный (5 µМ)1 µlTaq ДНК-полимераза (Qiagen)0,2 µlH2O18,3 µl86ИТОГО25 µlПЦР программа: 95°С – 5 мин, (94°С – 20 сек, 57/61°С – 45 сек, 72°С – 20 сек)х40циклов, 72°С – 5мин.Праймеры подбирали к последовательностям Pdu-twist, Pdu-mapk, Pdu-mapkk избазы данных http://4dx.embl.de/platy так, чтобы они находились в разных экзонах.Этим достигалось полное избавление результатов от возможной контаминации гДНК,посколькупротяженныеобласти,включающиеинтроны,немоглибытьамплифицированы в применявшихся условиях реакции.
В качестве референсного генаиспользовали Pdu-rps9, кодирующий белок рибосом S9, для которого показанопостоянство уровня экспрессии (Lidke et al., 2014). Для амплификации Pdu-twist и Pdumapk (ампликоны длиной 222 bp и 161 bp, соответственно) применяли температуруотжига +61°С, для Pdu-mapkk и Pdu-rps9 (ампликоны длиной 265 bp и 254 bp,соответственно) – +57°С.Праймеры:#2433 Pdu-twi_ex1_up2 CGAATGGAGGGTGCCTGGTC (Tm=65°С);#2330 Pdu-twi_ex2_lo1 TGGTCCAAGATCAGAAGACACC (Tm=62°С);Pdu-mapk_up1 GGTTCTCCAAGCACGGAAGACCT (Tm=67°С);Pdu-mapk_lo1 GGGTTGAACGTAAGCATTCTGTCC (Tm=65°С);#486 mapkk-ex5_for CAGCACAAAATGACGATAAAGGAG (Tm=62°С);#487 mapkk-ex7_rev CAAAATGCTGCTCTCCGTCAGG (Tm=64°С);#831 rps9_up ATGCCGCGCATACCATTGGTGTAC (Tm=67°С);#903 rps9_lo ACTCCAATACGGACCAGACG (Tm=61°С).Результаты ПЦР анализировали электрофорезом в агарозном геле.
Насделанных фотоснимках с помощью ImageJ измеряли интенсивность окраски полос(оптическую плотность). Через отношение этого показателя у ампликонов генаинтереса и у референсного гена рассчитывали относительный уровень мРНК вусловных единицах (за 1 принимали это значение в яйце).2.4. Анализ локализации белков и нуклеиновых кислотИммуноцитохимияЗародышей A. virens промывали через сито для клеточных культур с ячеей 40 µморской водой, отмывали от слизистой оболочки в TCMFSW (Tris + Ca/Mg-free seawater) 1–2 мин и незамедлительно фиксировали в течение ночи при +4°С в 4%87формалине на 1,75х фосфатном буфере с 0,1% Tween 20. TCMFSW (pH 8,0) состоит изсвежеприготовленных солей: Tris (конечная концентрация – 50 мМ), NaCl (495 мМ), KCl(9,7 мМ), Na2SO4 (27,6 мМ), NaHCO3 (2,3 мМ), ЭДТА (6,4 мМ) на дистиллированной воде(Костюченко, 1999; Kozin et al., 2016).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
