Диссертация (1145742), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Для RACE-ПЦР выбирали температуруплавления не ниже +65°С, обязательное наличие G или C на 3’ конце и наименьшую извозможных самокомплиментарность. Температуру плавления (Tm) определяли какпараметр Melting Temperature (Salt Adjusted), выдаваемый on-line сервисом Oligo Calc(http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html). Температуру отжига для ПЦР сHotStarTaq Plus ДНК-полимеразой (Qiagen) назначали на 3°С меньше Tm. В отсутствие71удовлетворительного результата температуру отжига подбирали выше и ниже Tm,используя градиентную ПЦР.Клонирование геновмРНК из зародышей или регенератов A.
virens и P. dumerilii выделяли с помощьюRNeasy Mini Kit – Purification of Total RNA from Animal Tissues (Qiagen) по протоколупроизводителя. Обратную транскрипцию проводили наборами Transcriptor High FidelitycDNA Synthesis Kit (Roche) – для получения полноразмерной кДНК – и SMARTer RACEcDNA Amplification Kit (Clontech) – для получения 5’ и 3’ кДНК, используя входящие внаборы стандартные праймеры.
Полученные библиотеки кДНК служили матрицей дляамплификации фрагментов генов интереса.Клонирование Avi-mox проводили в 2 этапа. Сначала с помощью вырожденныхпраймеров в ПЦР амплифицировали консервативный участок (часть гомеобокса),длиной 140 bp.Праймеры:mox_deg_up2 AARYTNGAYYTNAAYGCNAARCC (Tm=52–68°С, соответствует пептидуKLDLNAKP, степень вырожденности 4096);mox_deg_lo2ARRTCNARNGCNACNGCDATYTC(Tm=56–72°С,комплементаренпоследовательности, кодирующей пептид EIAVALDL, степень вырожденности 12288).ПЦР смесь:кДНК (полноразмерная)1 µl10х буфер (с 15 mM MgCl2)5 µldNTPs (10 mM)2,5 µlпраймер mox_deg_up2 (5 µМ)1,5 µlпраймер mox_deg_lo2 (5 µМ)1,5 µlTaq ДНК-полимераза (Qiagen)0,5 µlH2O38 µlИТОГО50 µlПЦР программа: 95°С – 5 мин, (94°С – 20 сек, 42→45°С – 2 мин, 72°С – 30 сек)х10циклов, (94°С – 20 сек, 47°С – 2 мин, 72°С – 30 сек)х35 циклов, 72°С – 10 мин.Полученный ПЦР продукт анализировали с помощью электрофореза вагарозном геле, вырезали и выделяли из геля китом QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).Фрагмент 140 bp лигировали в вектор, трансформировали бактериальные клетки,проверяли выросшие на селективной среде клоны в ПЦР с праймерами М13,72комплементарными векторной части плазмиды.
Клоны со вставкой инокулировали вночную культуру, выделяли из них плазмидную ДНК и отправляли ее насеквенирование с праймером М13.На следующем этапе в тачдаун-ПЦР амплифицировали 5’RACE-фрагмент Avimox.Геноспецифичный праймер: Nvi-mox_lo1 CCTCCGGAGTCTGGTCAAGTAGTTATGC(Tm=72°С).ПЦР смесь:5’ кДНК (разведенная 1:25)5 µl10х буфер (с 15 mM MgCl2)2,5 µlMgCl2 (25 mM)0,5 µldNTPs (10 mM)1 µlпраймер 10х UPM2,5 µlпраймер Nvi-mox_lo1 (5 µМ)2,5 µlTaq ДНК-полимераза (Qiagen)0,4 µlH2O10,6 µlИТОГО25 µlПЦР программа: 95°С – 5 мин, (94°С – 30 сек, 72→65°С – 1 мин, 72°С – 4 мин)х20циклов, (94°С – 30 сек, 63°С – 1 мин, 72°С – 4 мин)х30 циклов, 72°С – 10 мин.Полученный фрагмент Avi-mox длиной 958 bp (frkt#1292) клонировали, какописано выше для консервативного участка.5’RACE-фрагменты Avi-piwi1 (перекрывающиеся pi-6, 854 bp и pi-49, 1650 bp), Avievx (rk322, 772 bp), Pdu-evx (frkt#1287, 912 bp), 3’RACE-фрагменты Avi-evx (frkt#1293,1743 bp), Pdu-twist (frkt#1288, 1875 bp) амплифицировали, как и Avi-mox (frkt#1292), втачдаун-ПЦР.
Праймеры подбирались исходя из известной последовательностиклонированногоранеепоследовательностямконсервативногоизгеномнойучасткаи(дляA.транскриптомнойhttp://4dx.embl.de/platy (для P. dumerilii). Для Pdu-moxvirens)базыилиподанныхобширный фрагменткодирующей области (CDS) был выделен не в RACE-ПЦР, а в ПЦР с двумягеноспецифичными праймерами.Праймеры:pi_168_5R4 GGCTTGGTGACTACGGTGTCTACTATTG (Tm=70°С);#2253 nested_pi6_lo CAATGCTTTCTGCTCATCACGGCC (Tm=67°С);73Nvi-evx_up1 GATGAACGTCGAATGGGCCACGG (Tm=68°С);ev_286_5R2 GCGGCCAATTCGCATCTTCGTG (Tm=66°С);Pdu-evx_lo1 GGTCTGAGATTCCGTAGGGCCAAGC (Tm=71°С);#2328 Pdu-twi_ex1_up1 CTCGACTGGATTACTGCTAACG (Tm=62°С);Pdu-mox_up2 CGGGGCCTTTGCATCACTACC (Tm=65°С);Pdu-mox_lo2 TCTTTCAATTGGTCTTTGTCCTCCATTG (Tm=66°С).Секвенирование и анализ последовательностейСеквенирование плазмид и ПЦП продуктов по Сэнгеру производилоськоммерческими организациями (LGC Genomics, Microsynth AG) или в РЦ СПбГУ.Секвенирование ДНК из BAC-клонов осуществлялось в центре Genoscope по методу 454Life Sciences/Roche.Рутинный анализ последовательностей ДНК, РНК и белков проводили впрограммах CLC Main Workbench (Qiagen), BioEdit (Ibis Biosciences), ApE (A plasmidEditor).
Для выравнивания кДНК и гДНК использовали on-line сервисы SIM4(http://pbil.univ-lyon1.fr/members/duret/cours/inserm210604/exercise4/sim4.html)иSplign (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi). Предсказание ORF генов вгДНК осуществляли алгоритмами FGENESH (http://www.softberry.com/berry.phtml) иAugustus(http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus/).Длявыравниваниягеномныхлокусов и поиска консервативных участков некодирующей гДНК (EvolutionaryConserved Regions – ECR) использовали портал Mulan (https://mulan.dcode.org/).Наличие консервативных мотивов в UTR мРНК проверяли сервисами REPFIND(http://zlab.bu.edu/repfind/form.html)иUTRSite(http://utrsite.ba.itb.cnr.it).Аннотирование белковых последовательностей проводили по базам данных Pfam(http://xfam.org/) и PROSITE (http://prosite.expasy.org/).ФилогенетическийанализпроводилинасервереPhylogeny.fr(www.phylogeny.fr).
Для этого клонированные и секвенированные фрагменты геновинтереса транслировали в аминокислотные последовательности и предварительноопределяли их принадлежность к генетическому семейству, используя BLASTP.Полученные в результате наборы ортологов выравнивали по алгоритму MUSCLE 3.7 спараметрами определенияG-блоковпоумолчанию.ПоG-блокам методоммаксимального правдоподобия PhyML 3.0 с aLRT-тестом строили филогенетическуюсхему. Изображения дендрограмм получали в TreeDyn 198.3.74Идентификация клонов в геномной ВАС-библиотеке и аннотация генныхлокусовГеномная BAC-библиотека для A.
virens была произведена в фирме Bio S&T в2008 г. (образцы # QUO03409 и # QUO03587). Тип вектора этой библиотеки –pIndigoBAC-5, сайт клонирования – HindIII, средний размер вставки – порядка 100 kb.Совместно с Ф. Райбле в этой библиотеке с помощью радиоактивной саузернгибридизации было найдено от 5 до 12 клонов, позитивных по зондам к генам Avitwist, Avi-vasa, Avi-pl10, Avi-piwi1 и Avi-piwi2, протяженные 3’- и 5’RACE фрагментыкоторых были ранее клонированы Р.П. Костюченко.
Автором была проведенадальнейшая проверка клонов и выбор по 1 клону для каждого гена для отправки насеквенирование. Для этого клоны были высеяны на агаровые чашки, по 3 колониибыли инокулированы в жидкую культуру, из которой выделяли BAC-ДНК. ПрепаратыДНК были подвергнуты рестрикции (2 ч при +37°С) с EcoRI, HindIII и EcoRI+HindIII(Fermentas) после чего – фракционированы в 0,8% агарозном геле. Для дальнейшегоСаузерн-блоттинга гель помещали в денатурирующий раствор (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH)на 40 мин и в ренатурирующий раствор (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl pH 7,4) на 20 мин, азатем монтировали конструкцию для блоттинга. Под гель помещали фильтровальнуюбумагу, концы которой опускались в резервуар с 10x SSC, сверху на гель клалинейлоновую мембрану (Peqlab), а на нее – несколько слоев фильтровальной бумаги ибумажные салфетки, на самый верх сэндвича помещали груз. После переноса ДНК изгеля на мембрану в течение ночи блот разбирали, ДНК сшивали с мембраной в УФизлучении при помощи режима “auto-crosslink” в аппарате UV-crosslinker и оставлялимембрану высохнуть на 2 ч.Для Саузерн-гибридизации готовили радиоактивно меченные зонды.
Изплазмид rk155, rk242, rk236, rk139, rk263, rk229, rk230, rk232 рестриктазой EcoRIвырезали вставки с фрагментами генов Avi-twist, Avi-vasa, Avi-pl10, Avi-piwi1 и Avi-piwi2.Выделенные из геля линейные фрагменты ДНК в количестве 100 нг добавляли вреакцию синтеза зондов, собранную из набора RadPrime DNA Labeling System(Invitrogen). Мембраны с BAC-ДНК промывали в 2x SSC и предгибридизовали в Rapidhyb Buffer (GE Healthcare Amersham) при +65°С 30 мин. Зонды добавляли в буфер иоставляли для гибридизации при +65°С на ночь. После отмывок мембраны в 2xSSC+0,1% SDS и 0,2x SSC+0,1% SDS (по 2 раза 20 мин при +65°С) сигнал проявляли нафосфорной пластинке (GE Healthcare) с экспозицией 1–2 дня. Все манипуляции с75радиоактивнымиматериаламибылипроделаныФ.Райбле.Послепроявкиавторадиографически помеченные полоски на мембране сопоставляли с фрагментамина геле и определяли их длину.
По 1 BAC-клону с наибольшим суммарным размеромфрагментов, кодирующих гены интереса, было отправлено на секвенирование. Ихкоординаты в BAC-библиотеке: 69M19 (содержит локус Avi-twist), 91A1 (Avi-vasa), 94H8(Avi-pl10), 109A1 (Avi-piwi1), 87P17 (Avi-piwi2).Полученные после секвенирования каждого из клонов данные состояли изразличного числа контигов (от 5 до 19 шт) длиной от 0,1 до 52 kb. На этих контигах быликартированыизвестныепокДНКпоследовательностигеновинтереса.Длядальнейшего анализа требовалось установить наличие достаточного по длине участка“выше” (up-stream) от точки начала транскрипции, поскольку именно в 5’ области оттранскрибируемой последовательности могут быть расположены цис-регуляторныеэлементы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
