Диссертация (1145742), страница 20
Текст из файла (страница 20)
virens и 669 bp – у P. dumerilii) и семинуклеотидного фрагмента 3’UTR. Второй экзон содержит остальную часть 3’ UTR длиной 876 bp у A. virens и 1166 bp– у P. dumerilii. Последовательности кДНК были проверены с помощью базы данныхUTRSite на предмет специфических мотивов UTR. У обоих генов на 3’ конце быллокализован сигнал полиаденилирования (Polyadenylation Signal, PAS). У Pdu-twistкроме этого в 5’ UTR был обнаружен один сайт связывания с белком Musashi (Musashibinding element, MBE), а в 3’ UTR – еще три подобных сайта.Рис.
18. Геномные локусы гена Twist у нереид. Экзоны обозначены коричневымиблоками, белок-кодирующая область выделена оливковым. Цифрами обозначенадлина последовательности гДНК в bp.Предполагаемый белок Avi-twist (получаемый при трансляции CDS) состоит из204 aa, Pdu-twist – из 222 aa. При их выравнивании идентичными являются 169 аа(76%). Несколько ближе к С-терминальному концу полипептидов расположеныконсервативные домены bHLH и WR (Рис.
19).Филогенетический анализ белковых последовательностей Twist подтвердилортологичностьклонированныхгеновAvi-twistиPdu-twist(Рис.20).Нафилогенетическом древе Avi-twist и Pdu-twist стоят ближе всего к гомологам Twistполихеты Capitella и моллюска Crassostrea, но не формируют с ними четких кластеров,содержащих определенные паралоги. Кроме того, не наблюдается соответствияпаралогов Twist1 и Twist2 Capitella и одноименных последовательностей рыбки Danio и93мыши (Рис. 20), что говорит о независимых поздних дупликациях гена Twist унекоторых представителей Spiralia и позвоночных. Наибольшее сродство с гомологамипозвоночных по первичной структуре имеет единственный ортолог Twist актинииNematostella.
Особняком стоят, по-видимому, наиболее быстро дивергировавшие (чтоотражает длина их ветвей) последовательности насекомых. Напротив, для Avi-twist иPdu-twist характерна относительно небольшая длина ветви, превосходящая лишьдлину ветви Twist2 полихеты Capitella и Twist шелкопряда Bombyx, что свидетельствуето малой степени дивергенции этих четырех последовательностей.Рис. 19. Строение предполагаемых белковых продуктов Twist у нереид.
Фиолетовымвыделены консервативные домены bHLH и WR. Цифрами обозначена длинапоследовательности в аминокислотных остатках.Рис. 20. Филогенетическое древо аминокислотных последовательностей Twist пометоду максимального правдоподобия (Maximum likelihood). Для каждойпоследовательности приведен буквенно-цифровой код из базы NCBI. Оценкастатистической достоверности узла на основе aLRT обозначена цифрами.
Шкала вколичестве замен на позицию.С помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР,RT-PCR) была охарактеризована временная экспрессия гомолога Twist у P. dumerilii.мРНК Pdu-twist присутствует на всех изученных стадиях развития, начиная с94неоплодотворенного яйца и заканчивая средней нектохетой (96 чпо) (Рис.
21). Каквидно по интенсивности окраски полос на геле (относительной оптической плотности),в период дробления (начало формирования второго квартета микромеров (3,5 чпо),формирование четвертого квартета микромеров (5 чпо), формирование М-клеток (5,5чпо)) уровень экспрессии Pdu-twist примерно соответствует таковому в яйце. Заметноеувеличение относительного количества транскриптов Pdu-twist наблюдается со стадиипоздней гаструлы/протрохофоры (16 чпо). Наибольшей интенсивности экспрессия Pdutwist достигает на личиночных стадиях – у ранней трохофоры (24 чпо) и раннейметатрохофоры (48 чпо) (Рис.
21). У нектохет (72 чпо и 96 чпо) уровень экспрессиинесколько меньше, чем у более ранних личинок. Описанный паттерн временнойэкспрессии свидетельствует о том, что Pdu-twist является геном материнского эффекта,т.е. его мРНК запасается еще в период оогенеза.
Также можно с уверенностью говоритьоб активации зиготической экспрессии Pdu-twist во время гаструляции.Рис. 21. Результаты RT-ПЦР, отражающие временную динамику уровня экспрессии Pdutwist. Цифрами на шкале абсцисс обозначены стадии развития: 1 – выметанныенеоплодотворенные яйца (0 чпо); 2 – начало формирования второго квартетамикромеров (3,5 чпо), 3 – формирование соматобласта 4d и четвертого квартетамикромеров (5 чпо), 4 – переход к билатеральному дроблению и формирование Мклеток (5,5 чпо), 5 – поздняя гаструла/протрохофора (16 чпо), 6 – ранняя трохофора (24чпо), 7 – ранняя метатрохофора (48 чпо), 8, 9 – нектохета (72 чпо и 96 чпо). А –ампликоны Pdu-twist и референсного гена Pdu-rps9 на агарозном геле. Б – график срассчитанным относительным уровнем мРНК Pdu-twist.95Для изучения пространственного паттерна экспрессии Twist были проведеныэксперименты по выявлению мРНК гена Avi-twist у зародышей и личинок A.
virens спомощью молекулярной гибридизации in situ на тотальных препаратах (WMISH).Оказалось, что Avi-twist на всех рассмотренных стадиях онтогенеза дифференциальноэкспрессируется в мезодерме и ее производных (Рис. 22–24).Рис. 22. Распределение мРНК Avi-twist на ранних этапах эмбриогенеза. А–Г –гибридизация in situ, DIC; Д, Е – гибридизация in situ (красный канал), совмещенная сокраской ядер (синий) с помощью DAPI и выявлением тубулина (зеленый)флуоресцентными антителами, конфокальная микроскопия; Д – максимальнаяпроекция конфокального Z-стека; Е – отдельный конфокальный снимок.
А – позднеедробление, виден соматобласт 4d. Б – переход к билатеральному дроблению, Мклетки – единственная область экспрессии Avi-twist. В–Е – ранняя гаструла, появлениеэкспрессии Avi-twist в эктомезодерме. Время развития в чпо указано в верхнем правомуглу. Вид с вегетативного полюса. Энтомезодерма (клетки 4d и M) отмеченыоранжевым пунктиром, эктомезодерма (клетки третьего квартета микромеров 3a–3d) –белым пунктиром, вторичный мезобласт (6 мелких потомков М-клеток в дорсальнойгубе бластопора, предположительно – популяция ППК) показан белыми стрелками,dors, vent – дорсальная и вентральная сторона, соответственно, 4А, 4B, 4C, 4D –макромеры на дне бластопора.
Масштаб 25 мкм.Наиболее ранний дифференциальный сигнал мРНК Avi-twist был обнаружен впериодзавершениядробления(послеформированиячетвертогоквартетамикромеров, 13 чпо). В этот момент экспрессия приурочена к дорсальной сторонезародыша, т.е. к бластомерам D-квадранта. На субклеточном уровне мРНК Avi-twistпреимущественнораспределенапосвободной96отжелткацитоплазме.Прирассмотрении зародыша с вегетативного полюса сигнал Avi-twist наблюдается впределах соматобласта 4d (Рис. 22 А). После деления 4d (к 16 чпо) единственными Avitwist-положительными бластомерами становятся его потомки – М-клетки (Рис.
22 Б).После начала гаструляции (18 чпо) по бокам от мезотелобластов М начинаетвыявляться по одной относительно крупной клетке, которые вместе с М-клеткамиэкспрессируют Avi-twist на высоком уровне (Рис. 22 В). Указанные боковые клетки всоответствии с их расположением, формой и размером можно отнести к микромерам3с и 3d. Еще через несколько часов (к 20 чпо) мы наблюдали сигнал мРНК Avi-twist вмезотелобластах и четырех дополнительных клетках, лежащих на противоположныхсторонах бластопора (Рис. 22 Г). Поскольку указанные клетки находятся на поверхностизародыша и расположены вокруг центра гаструляции – бластопора – данный паттернэкспрессии Avi-twist можно назвать циркумбластопоральным.
С дорсальной стороныбластопор окаймляют потомки 4d (M-клетки), 3с и 3d, а клетки в вентролатеральныхположениях являются ни чем иным как микромерами 3а и 3b. Таким образом, наранних этапах гаструляции Avi-twist экспрессируется исключительно в мезодермальныхбластомерах: в энтомезодермальных М-клетках и полном наборе эктомезодермальныхклеток (микромерах третьего квартета 3а–3d).У нереидных полихет в ходе гаструляции путем эпиболии эктодермальныеклетки обрастают мезодермальные бластомеры, при этом бластопор постепеннозакрывается и смещается с вегетативного полюса кпереди, на вентральную сторону.Вместо бластопора здесь образуется стомодеальная пластинка – клеточный материалбудущей передней кишки.
В результате пролиферации из М-клеток формируютсябилатеральные мезодермальные полоски (МП), находящиеся между эктодермой имассой макромеров. На изученной нами стадии протрохофоры (32 чпо) каждая изполосок состоит из порядка 10-ти клеток различного размера. Avi-twist экспрессируетсяпримерно в половине этих клеток, расположенных в основном на дорсальной сторонеМП (Рис. 23). Наиболее интенсивный сигнал мРНК Avi-twist наблюдается в переднейчасти каждой МП, тогда как в мезотелобластах (терминальных задних клетках МП) этотсигнал существенно слабее. Помимо МП, Avi-twist продолжает экспрессироваться вэктомезодермальныхэлементах,сосредоточенныхпобокамиспередиотстомодеальной пластинки (Рис. 23).
Как правило, на этой стадии выявляется 3–4отдельных группы эктомезодермальных клеток: передние медиально расположенные97группы с сильным сигналом мРНК Avi-twist и латеральные группы, сзади примыкающиек МП, – с гораздо более слабым сигналом.Рис. 23. Экспрессия Avi-twist в конце эмбриогенеза у поздней гаструлы/протрохофоры(32 чпо). А–В – гибридизация in situ, DIC ; Г–Е – гибридизация in situ (красный канал),совмещенная с окраской ядер (синий) с помощью DAPI и выявлением тубулина(зеленый) флуоресцентными антителами, максимальная проекция конфокального Zстека. А, Б – вегетативная проекция, разные фокальные плоскости одного и того жезародыша; В, Е – дорсальная проекция, глубокий фокус; Г, Д – латеральная проекция,дорсальная сторона справа, разные фокальные плоскости одного и того же зародыша.Энтомезодерма (мезодермальные полоски) отмечена оранжевым пунктиром,экспрессия в них показана белыми стрелками, экспрессия в эктомезодерме –оранжевыми треугольниками, Х – вегетативный полюс (область проктодеума),звездочка – область стомодеума, зеленый пунктир – положение прототроха.
Масштаб25 мкм.На стадии ранней трохофоры, когда личинки начинают плавать (43 чпо),эктомезодермальные Avi-twist-положительные клетки спереди от стомодеальнойпластинки сближаются, так что формируется единый вытянутый в поперечномнаправлениидоменэкспрессии(Рис.24А).Влатеральныхгруппахэктомезодермальных клеток сигнал Avi-twist становится гораздо лучше различимым.Эти латеральные домены экспрессии по переднезадней оси находятся почти на одномуровне с передними эктомезодермальными клетками.
В пределах МП экспрессия Avitwist приобретает метамерный характер (Рис. 24 А). На каждую МП приходится по 3домена экспрессии, захватывающие наиболее дорсальные энтомезодермальныеклетки. Расположение этих доменов вдоль переднезадней оси МП указывает на то, что98они, возможно, маркируют передние границы формирующихся мезодермальныхкомпартментов. Наиболее яркие и обширные энтомезодермальные зоны экспрессиинаходятся на передней границе каждой МП. Терминальных мезотелобластов(отличимых более крупными размерами) на задних концах МП выявить на этой стадиине удается (вне зависимости от наличия или отсутствия экспрессии Avi-twist).Рис. 24.
Экспрессия Avi-twist (А–Д) и Avi-mox (Е–К) в начале ларвального развития.Гибридизация in situ, DIC. А, Е – ранняя трохофора (43 чпо); Б, В – средняя трохофора(59 чпо); Г, Д, И, К – ранняя метатрохофора (90 чпо); Ж, З – средняя трохофора (54 чпо).А, Б, Г, Е, Ж, И – вентральная проекция; В, Д, З, К – латеральная проекция, дорсальнаясторона справа. Энтомезодерма (мезодермальные полоски) отмечена оранжевымпунктиром, метамерность экспрессии в гипосфере показана черными стрелками,экспрессия в эктомезодерме – оранжевыми треугольниками, Х – вегетативный полюс(область проктодеума), звездочка – область стомодеума, + – хетоносный мешок.Масштаб 25 мкм.На стадии средней трохофоры (59 чпо) Avi-twist экспрессируется примерно наодинаковом высоком уровне как в энто-, так и в эктомезодермальных тканях (Рис. 24 Б,В).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
