Диссертация (1145742), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Последние расположены непосредственно над и по бокам (несколько ближе кзаднейгранице)отсформированногостомодеума.Сзадилатеральныеэктомезодермальные домены экспрессии все так же примыкают к передним концамМП. В самих МП экспрессия Avi-twist наблюдается в заметно большем количествеболее мелких клеток, чем на предшествующей стадии (Рис. 24 Б, В). Паттернэкспрессии в энтомезодерме является отчетливо метамерным, вдоль переднезаднейоси МП отличимы более обширные, чем ранее, домены, причем самый заднийклеточный домен в каждой МП крупнее передних двух.99В целом следует отметить, что, начиная со стадии протрохофоры, количествоAvi-twist-положительных клеток неуклонно растет, они погружены внутрь зародыша и,как и на стадии гаструлы с циркумбластопоральным паттерном экспрессии,расположеныпокругу, окаймляя вентральную часть гипосферы.Вместесконвергентным вытяжением, происходящем в эктодермальных тканях, изменяетсяструктура и расположение мезодермальных зачатков: группы эктомезодермальныхклеток сближаются друг с другом, МП вытягиваются вдоль переднезадней оси иметамеризуются.Начиная со стадии ранней метатрохофоры у нереидных полихет следуетговорить о дифференциации МП, которая проявляется в постепенном созреваниимускулатуры гипосферы (Wilson, 1892; Fischer et al., 2010).
Метамерный характерэкспрессии Avi-twist сохраняется на этой стадии. мРНК Avi-twist локализуется в группахклеток вокруг пучков щетинок, лежащих в хетоносных мешках будущих параподий(Рис. 24 Г, Д). Каждый из шести пар хетоносных мешков примерно посередине егопроксимодистальной оси опоясан кольцом клеток, экспрессирующих Avi-twist навысоком уровне. Такое расположение полностью соответствует месту формированияпараподиальных мышц (Fischer et al., 2010). Эктомезодермальный домен экспрессииAvi-twist приобретает вид сначала незамкнутого на задней границе (Рис. 24 Г), апозднее замкнутого кольца вокруг стомодеума. Кроме того, экспрессия Avi-twistвыявляется в более глубоких медиальных клетках, примыкающих к многослойномуэпителию эписферы, из которого формируется головной мозг.3.1.2. MoxДля гомолога Mox A.
virens нам удалось отклонировать лишь 5’ фрагмент кДНКпротяженностью 1019 bp (Рис. 25), который содержит 5’ UTR (длиной 347 bp) и частьORF (длиной 672 bp), соответствующую N-концевой части CDS Mox других животных.Поиск в геномной и транскриптомной базе данных P. dumerilii выявил лишь одингомолог Mox у этого червя.
Фрагмент предполагаемой белковой последовательностиAvi-mox состоит из 224 аа, последние 50 аа которого входят в состав консервативногогомеодомена (Рис. 26).Филогенетический анализ аминокислотной последовательности подтвердилпринадлежность Avi-mox соответствующему семейству ТФ (Рис. 27). Avi-mox имеетодну из наиболее коротких ветвей. На дендрограмме он формирует четкий кластер с100гомологами Mox других Spiralia – аннелид и моллюсков. Наибольшее сродство этоткластер имеет к гену MoxA актинии Nematostella (Рис. 27). Последовательностипозвоночных формируют на филогенетическом древе общую ветвь, причем друг сдругомгруппируютсяодноименныепаралогиMox1рыбкиDanioимыши(Dre_mox1_NP_001002450 с Mmu_mox1_NP_034921).
В основании древа находятсяпоследовательности Mox насекомых, характеризующиеся достаточно выраженнымразбросом длины ветвей.Рис. 25. Строение 5’ концевого фрагмента транскрипта гена Mox у A. virens. Зеленымотмечена некодирующая часть, белок-кодирующая область выделена оливковым.Цифрами обозначена длина последовательности кДНК в bp.Рис. 26. Строение N-концевого фрагмента предполагаемого белкового продукта Mox уA. virens. Фиолетовым выделен консервативный гомеодомен.
Цифрами обозначенадлина последовательности в аминокислотных остатках.Рис. 27. Филогенетическое древо аминокислотных последовательностей Mox пометоду максимального правдоподобия (Maximum likelihood). Для каждойпоследовательности приведен буквенно-цифровой код из базы NCBI. Оценкастатистической достоверности узла на основе aLRT обозначена цифрами. Шкала вколичестве замен на позицию.101Пространственно-временной профиль экспрессии Avi-mox был изучен спомощью гибридизации in situ. Наиболее раннюю экспрессию удалось выявить настадии ранней трохофоры. В это время мРНК Avi-mox локализуется в небольшомколичестве энтомезодермальных клеток на переднем конце МП (Рис. 24 Е).
Данноерасположение примерно соответствует самому переднему из метамерных доменовэкспрессии Avi-twist на соответствующей стадии (Рис. 24 А). Позднее, на стадиисредней трохофоры, экспрессия Avi-mox распространяется по всей длине МП и имеетотчетливо метамерный характер (Рис. 24 Ж, З).
Как и в случае с Avi-twist на каждую МПприходится по 3 домена экспрессии (Рис. 24 Б, Ж). Отличие же от паттерна Avi-twistсостоит в уменьшении размеров этих метамерных доменов Avi-mox спереди назад, т.е.наиболее крупным является передний домен, а не задний, как в случае Avi-twist. В этоже время над стомодеумом появляется небольшая группа эктомезодермальных Avimox-положительных клеток (Рис. 24 Ж).На стадии ранней метатрохофоры вдобавок к несколько увеличившемусяпереднему медиальному эктомезодермальному домену по бокам от стомодеумавозникаютновыебилатерально-симметричныеэктомезодермальныедоменыэкспрессии Avi-mox (Рис.
24 И). Эти латеральные домены существенно меньшедоменов экспрессии Avi-twist в соответствующей области и, по-видимому, полностьюперекрываются с последними. В энтомезодерме метамерность паттерна экспрессииAvi-mox сохраняется, хотя и становится менее отчетливой. В сравнении с трохофорнойличинкой,областьэнтомезодермальныхAvi-mox-положительныхклетокуметатрохофор сильно увеличивается, особенно в поперечном направлении. Впередних участках МП домены экспрессии Avi-mox значительно шире по сравнению стаковыми на заднем конце МП.
Сравнивая энтомезодермальные паттерны экспрессииAvi-mox и Avi-twist можно отметить, что они более не пересекаются: сигнал мРНК Avimox выявляется в клетках, расположенных гораздо более вентрально (в зачатках косыхмышц и/или целомических мешков), причем эти клетки граничат лишь с базальнымичастями вентральных хетоносных мешков (Рис.
24 К).3.1.3. EvxУ A. virens протяженность клонированного из кДНК гомолога Evx составляет 2305bp (Рис. 28). Эта последовательность включает 5’ UTR (длиной 230 bp), ORF (длиной1251 bp), соответствующую CDS Evx других животных и 3’ UTR (длиной 824 bp). Поиск в102геномной и транскриптомной базе данных P. dumerilii выявил лишь один гомолог Evx уэтого червя. Предполагаемый белок Avi-evx состоит из 416 aa, в центральной его частизакодирован консервативный гомеодомен (Рис. 29).Рис. 28.
Строение транскрипта гена Evx у A. virens. Зеленым отмечена некодирующаячасть, белок-кодирующая область выделена оливковым. Цифрами обозначена длинапоследовательности кДНК в bp.Рис. 29. Строение предполагаемого белкового продукта Mox у A. virens. Фиолетовымвыделенконсервативныйгомеодомен.Цифрамиобозначенадлинапоследовательности в аминокислотных остатках.Рис. 30. Филогенетическое древо аминокислотных последовательностей Evx по методумаксимального правдоподобия (Maximum likelihood).
Для каждой последовательностиприведен буквенно-цифровой код из базы NCBI. Оценка статистической достоверностиузла на основе aLRT обозначена цифрами. Шкала в количестве замен на позицию.С помощью филогенетического анализа аминокислотной последовательностиAvi-evx была подтверждена ее принадлежность к семейству Evx (Рис. 30).Кластеризация гомологов Evx отмечена для последовательностей насекомых ипозвоночных. Как и в случае с генами Mox, одноименные паралоги Evx1 рыбки Danio и103мыши (Dre_evx1_NP_ 571324 с Mmu_evx1_NP_031992) группируются вместе, чтоговорит о дупликации обоих Hox-связанных гомеобокс-содержащих генов Mox и Evx уобщего предка позвоночных.
Напротив, недавняя дупликация Evx произошла уполихеты Capitella (Seaver et al., 2012), что отображено на древе в виде общей ветви,ведущей к практически не дивергировавшим друг от друга последовательностямCte_evx1_AFJ66236 и Cte_evx2_AFJ66237 (Рис. 30). Остальные гомологи Evx спиралийразбросаны на дендрограмме по ветвям разного порядка. Avi-evx характеризуетсянаименьшей длиной ветви, немногим большую длину имеют последовательности P.dumerilii и моллюска Crassostrea.По данным гибридизации in situ Avi-evx экспрессируется у эмбрионов и личинокA.
virens в клетках, принадлежащих как эктодермальному, так и мезодермальномузародышевому листку. Самая ранняя дифференциальная экспрессия Avi-evx отмеченасо стадии протрохофоры. Обширный эктодермальный домен экспрессии охватываетповерхностные клетки (потомки соматобласта 2d) на дорсальной и вегетативнойстороне зародыша (Рис. 31 А–Г). Одновременно с этим сигнал мРНК Avi-evx выявляетсяво всех клетках МП (Рис. 31 Б, В). Уже к стадии ранней трохофоры этаэнтомезодермальная экспрессия практически полностью исчезает: всего 2–4 наиболееглубинные мелкие клетки у переднего края МП остаются Avi-evx-положительными (Рис.31 Е, Ж). Вид эктодермального домена экспрессии также кардинально меняется. Онприобретает форму подковы, обрамляющей вегетативный полюс и открытой свентральной стороны (Рис.
31 Д–З). Можно отметить, что этот домен экспрессии Avi-evxфактически маркирует заднюю и боковые границы интернализуемой эктодермы, т.е.материала передней и задней кишки – стомодеума и проктодеума, которые занимаетместо бывшего бластопора.На стадии средней трохофоры поверхностная эктодермальная областьэкспрессии продолжает видоизменяться, приобретая форму ракетки (Рис.
31 И–М). Навегетативном полюсе расположен овальный пятнистый домен, вытянутый вдорсовентральномнаправлении.распространяетсямедиальнаяОтэтогополоскадоменанавентральнуюAvi-evx-положительныхсторонуклеток,оканчивающаяся немного не доходя до задней границы стомодеума (Рис. 31 И, Л, М).В пределах описанной полоски экспрессия Avi-evx наблюдается во всей толщемногослойной нейроэктодермы. На уровне переднего края этой полоски по бокамвыявляется по 2 пары отдельных клеток или небольших клеточных групп базального104слоя нейроэктодермы, экспрессирующих Avi-evx (Рис.
31 И). В МП у средних трохофороченьслабыйсигналмРНКAvi-evxедвауловимвнесколькихпереднихэнтомезодермальных клетках (Рис. 31 К).Рис. 31. Экспрессия Avi-evx в ходе развития. Гибридизация in situ, DIC. А–Г –протрохофора (32 чпо); Д–З – ранняя трохофора (43 чпо); И–М – средняя трохофора (59чпо); Н–Р – ранняя метатрохофора (90 чпо). А, Д, И, Н – вентральная проекция; Б, Е, К, О– вентральная проекция, глубокая фокальная плоскость; В, Ж, Л, П – латеральнаяпроекция, дорсальная сторона справа; Г, З, М, Р – вегетативная проекция.Энтомезодерма (мезодермальные полоски) отмечена оранжевым пунктиром, доменэкспрессии на переднем крае МП показан черными стрелками, экспрессия в эктодерме– синими треугольниками, экспрессия в нейроэктодермальных клетках – синимистрелками, экспрессия в клетках вблизи хетоносных мешков – зелеными стрелками, Х –вегетативный полюс (область проктодеума), звездочка – область стомодеума, + –хетоносный мешок.
Масштаб 25 мкм.105На стадии ранней метатрохофоры экспрессия Avi-evx подвергается ещебольшему сокращению (Рис. 31 Н–Р). Ни в каких мезодермальных производныхсигнала не наблюдается. На вентральной стороне гипосферы экспрессия Avi-evxотмечена в нескольких отдельных клетках, лежащих в средних по глубине слояхнейроэктодермы (Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
