Диссертация (1145742), страница 17
Текст из файла (страница 17)
В первоначально полученных контигах искомые участки составляли 0,5 kb уAvi-pl10, 1,3 kb у Avi-vasa, 1,5 kb у Avi-piwi2, 1,7 kb у Avi-piwi1, 11,4 kb у Avi-twist. Дляувеличения размеров этих областей и восстановления последовательностей междуконтигами использовали ряд подходов: секвенирование BAC по Сэнгеру, сравнение споследовательностями из базы данных генома P. dumerilii и предсказание CDS в гДНК insilico с последующей ПЦР со специфическими праймерами и секвенированиемпродуктов, TAIL-ПЦР (Thermal Asymmetric Interlaced PCR).
В результате нам удалосьреконструировать протяженные последовательности BAC-клонов, содержащие полныелокусы генов интереса, включая участки не менее 5 kb up-stream от точки началатранскрипции. Для Avi-vasa длина соединенных в правильном порядке контиговсоставила 50 kb из 83 kb (общей длины гДНК, содержащейся в просеквенированнойBAC), для Avi-pl10 – 23 kb из 110 kb, для Avi-piwi1 – 33 kb из 150 kb, для Avi-piwi2 – 83 kbиз 83 kb, для Nvi-twist – 24 kb из 141 kb.ВАС-рекомбинацияМодификация клона 69M19, содержащего локус гена Avi-twist, была выполненапо протоколу BAC-рекомбинации (Ejsmont et al., 2009).
В результате в эндогеннуюрамку считывания Avi-twist была встроена репортерная кассета, кодирующая eGFP инитроредуктазу (NTR) (Рис. 14, 15). Эту кассету амплифицировали с плазмиды pR6KE2N-FRT (frkt#894) с праймерами, которые содержали на 5’ конце некомплиментарныематрице участки в 50 bp, соответствующие фланкам интеграции в BAC:#2233 Nvi-twi_locus_HA1_eGFP_cassette_ATG+6aa_fus_up (Tm=68°С)76tgtggtttgagccctcttcgctggattaaatgagtgttatggtacctgagATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC#2234 Nvi-twi_locus_HA2_eGFP_cassette_exon1_75-124bp_lo (Tm=62°С)catgatgagggccggagttcgaagttgctgctgattgtggatgttgtttcTAACAGATGAGGGCAAAGCGCTПЦР программа: 98°С – 1 мин, (98°С – 10 сек, 62°С – 30 сек, 72°С – 2 мин)х30циклов, 72°С – 5 мин.Рис.
14. Принцип ВАС-рекомбинации для создания репортерного трансгена. Вкодирующую область гена интереса (синий блок CDS) внедряется последовательностьзеленого флуоресцентного белка GFP. Остальные области генетического локусаостаются неизмененными, что обеспечивает полноту контекста, регулирующегоэкспрессию трансгена.Рис. 15. Генетические конструкции для ВАС-рекомбинации. А – строение репортернойкассеты pR6K-E2N-FRT. Б – амплифицированная кассета с фланками интеграции (hm)длиной 50 bp.
В – плазмида pRedFlp4, обеспечивающая экспрессию системы белков77рекомбинации Red/ET. Г – целевая ВАС, в которую встраивается репортерная кассета. Д– рекомбинантная ВАС.Продукт реакции длиной 3,6 kb после электрофореза выделяли из агарозногогеля и использовали для трансформации BAC-клона. Бактериальные клетки клона69M19предварительнотрансформировалиплазмидойpRedFlp4(frkt#893)ииндуцировали экспрессию системы белков рекомбинации Red/ET добавлением в средуL-рамнозы. Все трансформации проводили путем электропорации в 2 мм кюветах (BioRad) с параметрами 2500 V, 25 μF, 250 Ohm.
Трансформированные клетки отбирали наагаровых чашках с селективной средой. Корректность рекомбинации проверяли спомощью ПЦР на колониях. Использовали 2 пары праймеров, один из которыхсоответствовал фланкирующей области сайта интеграции, а второй распознавалпоследовательность в кассете pR6K-E2N-FRT:#2239 Nvi-twist_locus_HA1_control_up AATGAGTGTGAAGTATGGCTGC (Tm=60°С);#1746 eGFP_pR6K-E2N-FRT_HA1_control_lo GCAGCTTGCCGGTGGTGC (Tm=63°С);#1747 neo_HA2_control_up Tm = 60 GGCTACCCGTGATATTGCTG (Tm=60°С);#2240 Nvi-twist_locus_HA2_control_lo TTCTTGCGCTTCCGACTGCC (Tm=62°С).У рекомбинантных клонов ангидротетрациклином индуцировали экспрессиюфлиппазы, которая выщепляла из репортерной кассеты ген rpsLneo, определяющийустойчивость к антибиотику.
Бактериальные клетки высевали на агаровые чашки ипроверяли колонии в ПЦР с праймерами #2239 Nvi-twist_locus_HA1_control_up и #2240Nvi-twist_locus_HA2_control_lo.Следующим шагом по созданию наследуемого в череде поколений трансгенабыло введение в векторную область BAC кассеты с последовательностямитранспозонов, обеспечивающих интеграцию трансгена в геном хозяина. Для этогоиспользовали кассету с транспозонами Tol2. По аналогии с первым этапомрекомбинации с помощью ПЦР на плазмиде piTol2-kan (frkt#979) получали линейнуюДНК, фланкированную последовательностями праймеров:#2238 Nvi_pIndigoBAC_HA1_piTol2_up2 (Tm=63°С)ttctctgtttttgtccgtggaatgaacaatggaagtccgagctcatcgctCCCTGCTCGAGCCGGGCCCAAGTG#1739 Nvi_pIndigoBAC_HA2_piTol2_lo (Tm=63°С)agccccgacacccgccaacacccgctgacgcgaaccccttgcggccgcatAATTCATTATGATCCTCTAGATCAGATCT78Данной кассетой трансформировали BAC-клон с индуцированной экспрессиейRed/ET.
Отобранные с агаровой чашки колонии проверяли в ПЦР с 2 парамипраймеров:#1750 Nvi_pIndigoBAC_HA1_control_up GGCGTTTCCGTTCTTCTTCG (Tm=60°С);#1752 piTol2_HA1_control_lo GGGTAGGGGGTCAAGAACC (Tm=62°С);#1751 Nvi_pIndigoBAC_HA2_control_lo GAATGGCGCCTGATGCGG (Tm=61°С);#1753 piTol2_HA2_control_up GGTACCGGCATATGGTTCTTG (Tm=61°С).BAC-ДНК выделяли после каждого акта перестройки и подвергали рестрикции сEcoRV и XhoI, чтобы подтвердить целостность рекомбинантной BAC (Рис. 43).Корректность интеграции введенных кассет в итоговой BAC была проверена с помощьюсеквенирования продуктов контрольных ПЦР, содержащих сайты интеграции. Такимобразом, была получена готовую генетическую конструкцию pTol{Avi-twist::eGFP-F2ANTR}.
Для микроинъекций BAC-ДНК была выделена с помощью набора EndoFreePlasmid Maxi Kit (Qiagen) и хранилась при +4°С.Проверка активности транспозазы Mos1 in vivoДляполучениямРНКтранспозазыMos1плазмидуpCS2+Mos1frkt574линеаризовали рестриктазой NotI-HF (NEB), проверяли электрофорезом, вырезали ивыделяли из агарозного геля и использовали в качестве матрицы для транскрипции invitro.
Синтез РНК ставили на ночь при +37°С, используя набор mMESSAGE mMACHINESp6 Kit (Ambion). РНК выделяли набором RNeasy Mini Kit – RNA clean up (Qiagen),проверяли качество продукта электрофорезом, делали аликвоты и хранили при -80°С.В зиготы P. dumerilii инъецировали плазмидную ДНК вектора-донораpMos{rps9::egfp}frkt1074 (С=200 нг/мкл) с или без мРНК транспозазы (С=200 нг/мкл). Через4 ч после микроинъекций зародышей проверяли на наличие флуоресценции TRITC ипереваривали протеиназой К (2 ч при +56°С). Лизат использовали в ПЦР с праймерами,комплементарными векторной области и отстоящими от границ транспозона на542/223 bp:#1309 M1f CCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTTTATGG (Tm=69°С);#2254 M1r CTTGCATGCTCCGCTGTTTTGTCAGTG (Tm=70°С).ПЦР смесь:лизат из зародышей2 µl10х CL буфер (с 15 mM MgCl2)2 µldNTPs (10 mM)0,8 µl79праймер #1309 M1f (5 µМ)1 µlпраймер #2254 M1r (5 µМ)1 µlTaq ДНК-полимераза (Qiagen)0,25 µlH2O12,95 µlИТОГО20 µlПЦР программа: 95°С – 5 мин, (95°С – 30 сек, 69°С – 30 сек, 72°С – 1 мин)х35циклов, 72°С – 10 мин.По 1 мкл продукта реакции использовали в качестве матрицы для гнездовойПЦР (состав реакции идентичен первой ПЦР, в программе отличалась температураотжига – 67°С).
Праймеры для гнездовой ПЦР отстояли от границ транспозона на245/96 bp:#2255 M1nf TGACCATGCGCACTTCCACTTTCGTG (Tm=70°С);#2259 M1nr GAGCGAACGCAGACGAGTAAAACG (Tm=67°С).Полученные ампликоны анализировали электрофорезом в агарозном геле (Рис.40 В), вырезали, выделяли и лигировали в вектор.Генотипирование по Pdu-twistОпределение последовательностей Pdu-twist, присутствующих в популяциикультивируемых в лабораторных условиях P. dumerilii, проводили с помощью ПЦР нагДНК червей (по 3 образца из инбредных линий PIN, VIO, FL2). Праймеры подбирали кграницам экзонов, определенным после аннотирования локуса Pdu-twist из геномнойбазы данных по клонированной кДНК.Праймеры:#2328 Pdu-twi_ex1_up1 CTCGACTGGATTACTGCTAACG (Tm=62°С);#2329 Pdu-twi_ex1_lo1 ATATCAGTGGCCGTTGACTCC (Tm=61°С);#2330 Pdu-twi_ex2_lo1 TGGTCCAAGATCAGAAGACACC (Tm=62°С);#2432 Pdu-twi_ex1_lo2 GAGGGTGGGGATGATCTTTCTG (Tm=64°С).ПЦР смесь:ДНК1 µl5х HF буфер (с 7,5 mM MgCl2)5 µldNTPs (10 mM)0,5 µlпраймер #2328 (5 µМ)2,5 µlпраймер #2329 или #2330 (5 µМ) 2,5 µlPhusion ДНК-полимераза (NEB)0,25 µl80H2O13,25 µlИТОГО25 µlПЦР программа: 98°С – 1 мин, (98°С – 10 сек, 62°С – 1 мин, 72°С – 3 мин)х35циклов, 72°С – 5 мин.Для амплификации первого экзона использовали пару праймеров #2328 и#2329, для получения первого экзона, интрона и начала второго экзона – #2328 и#2330.
Ампликоны из реакций с образцами PIN и VIO клонировали и подвергалирестрикции с HinfI. После секвенирования и выравнивания в последовательностипервого экзона определяли полиморфные позиции SNP.Для генотипирования области первого экзона Pdu-twist, в которой искали TALENиндуцированные indel-мутации, использовали ПЦР, в норме амплифицирующуюфрагмент длиной 483 bp. В качестве матрицы использовали лизированныепротеиназой К (2 ч при +56°С) личинки или ампутированные задние концы телаювенильных червей.ПЦР смесь:лизат2 µl10х CL буфер (с 15 mM MgCl2)2 µldNTPs (10 mM)0,8 µlпраймер #2328 (5 µМ)0,8 µlпраймер #2432 (5 µМ)0,8 µlTaq ДНК-полимераза (Qiagen)0,12 µlH2O13,48 µlИТОГО20 µlПЦР программа: 95°С – 5 мин, (94°С – 20 сек, 60°С – 45 сек, 72°С – 30 сек)х35циклов, 72°С – 5мин.Для выявления в полученном ампликоне мутаций, затрагивающих спейсернуюобласть между сайтами связывания сконструированных TALEN twi-2L и twi-2R или twi3L и twi-3R, ставили рестрикцию с BamHI (NEB) – 2 ч при +37°С.
В случае рестрикцииампликона 483 bp из аллелей Pdu-twist А и В дикого типа образуется 2 фрагментадлиной 315 bp и 168 bp.Состав реакции:рестриктаза BamHI (NEB)0,5 µl10х буфер № 4 (NEB)1,5 µl81продукт ПЦР реакции8 µlH2O5 µlИТОГО15 µlПо 8 мкл ПЦР реакции до и после рестрикции загружали в соседние лункиагарозного геля и анализировали электрофорезом (Рис. 50). Присутствие на дорожке срестрикцией непереваренного фрагмента длиной около 0,5 kb свидетельствовало опроизошедшей мутации. Такие ампликоны вырезали, выделяли из геля, клонировали исеквенировали.Дизайн и клонирование сайт-специфических нуклеаз TALENTranscription activator-like effector nucleases (TALENs) являются синтетическимибелками, которые состоят из набора ДНК-связывающих доменов с вариабельнымидвумя аминокислотами – Repeat Variable Diresidue (RVD), отвечающими зараспознавание одного из нуклеотидов, и нуклеазного домена FokI (Рис.
16). БелкиTALEN связываются со специфическим участком ДНК (он определяется набором RVD) идействуют в паре, так что при димеризации нуклеазных доменов они вносят в ДНКдвунитевойразрыв.Внутриклеточныесистемырепарациивосстанавливаютцелостность ДНК, но в отсутствие матрицы механизм NHEJ приводит к случайнымделециям и инсерциям (indel-мутациям) в области спейсера – между сайтамисвязывания TALEN (Рис. 16). Сконструировав TALEN для кодирующей области гена,можно добиться генетического нокаута за счет сдвига рамки считывания послерепарации или крупной делеции ДНК, кодирующей функциональный домен.Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
