Диссертация (1145742), страница 15
Текст из файла (страница 15)
В отличие от эктодермы, мезодермальные полоски могут оставатьсяоднородными вплоть до стадии нектохеты (Беклемишев, 1964). К тому же взоологической литературе обосновано, что расчленение мезодермальных полосокпроисходит не самостоятельно, а под влиянием метамерного расположения другихорганов, таких как зачатки параподий или пучки мезенхимных мышц. Однакосуществуют и исключения. Так, у Scoloplos armiger целомические мешки образуютсяеще до сегментации эктодермальных покровов (Anderson, 1973).Принципиальные различия в строении и развитии мезодермы ларвальныхсегментов полихет послужили основой для теории П.
П. Иванова о первичнойгетерономности тела (Iwanoff, 1928; Иванов, 1944). Это теоретическое обобщение вобласти эмбриологии сравнимо по значимости с теорией зародышевых листков.ПоследовавшаякритикатеорииИвановазначительносузилаграницыееприменимости, фактически оставив бесспорным гетерономность сегментов лишь унескольких семейств полихет (Иванова-Казас, 1977; Anderson, 1973). Тем не менее,проблема строения, индивидуального и исторического развития сегментированных66животных по сей день остается предметом дискуссий (Shimizu, Nakamoto, 2001; Tautz,2004; Couso, 2009).Как мы могли убедиться, формирование мезодермы и ее производных остаетсяво многом неизученным, но принципиально важным вопросом для эмбриологии иэволюционной биологии.
Качественно новые методы анализа могли бы прояснитьмногие частные и общие закономерности развития мезодермы Spiralia. Нереидныеполихеты представляются удобной и перспективной моделью для подобныхисследований.67Глава 2. Материалы и методы2.1. Использованная техника и материалыОборудованиеФлуоресцентные микроскопы Axio Imager D1 и Axioplan2 (Carl Zeiss);конфокальные микроскопы LSM 510 (Carl Zeiss), TCS SP5 (Leica Microsystems);инвертированный микроскоп Leica DM IL (Leica Microsystems);микроинжектор FemtoJet Express (Eppendorf);микроманипулятор TransferMan NK2 (Eppendorf);термоциклеры Bio-Rad Т100, Quattro Chassi (VWR);микроцентрифуги MicriCen 13A (Herolab), Eppendorf 5424R, Heraeus Pico 17(Thermo Scientific);твердотельные термостаты Гном (ДНК-Технология), BioSan CH-100, ThermomixerCompact (Eppendorf);спектрофотометры NanoDrop (Peqlab), SmartSpec Plus (Bio-Rad);камеры для горизонтального электрофореза AGT2 (VWR), MSMINI (Biozym),Helicon SE-2;источники питания VWR 250V, Эльф-8 (ДНК-Технология);система гель-документации Alphaimager HP (Biozym).Векторы, плазмиды и компетентные бактериальные клеткиРутинное клонирование амплифицированных фрагментов ДНК производили вкоммерческие векторы с тупыми концами – pJET1.2 (Thermo Scientific) и с липкимиконцами – pGEM-T, pGEM-T Easy (Promega), pCRII-TOPO (Invitrogen).
С помощьюстандартных праймеров М13 с полученными плазмидами проводили секвенированиеи транскрипцию in vitro для синтеза РНК-зондов, используемых в гибридизации in situ.Для получения мРНК, пригодной для инъекций в зародыши, кДНК клонировали ввекторpCS2+(Addgene).ДляконструированияпоследовательностейTALENиспользовали набор плазмид Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0 (Addgene1000000024) и векторы доставки pCS2TAL3-DD и pCS2TAL3-RR (Addgene 37375, 37376).ПлазмидыдлятрансгенезаспомощьютранспозонаMos1–pMos{rps9::egfp}frkt1074 и pCS2+Mos1frkt574 были сконструированы и предоставлены Б.Бэкфишем и Ф. Райбле (Backfisch et al., 2013; Backfisch et al., 2014).
Для ВАСрекомбинации использовались плазмиды pRedFlp4 (frkt#893) и pR6K-E2N-FRT (frkt#894)68(Ejsmont et al., 2009), piTol2-kan (frkt#979) (Suster et al., 2011), полученные отсоответствующих авторов. Плазмиды, содержащие RACE-фрагменты гомологов Twist(rk155), Avi-evx (rk322), Vasa (rk242, rk235, rk236), PL10 (rk139, rk263) и Piwi (rk229, rk230,rk232) у A.
virens, были получены и предоставлены Р.П. Костюченко. В ходе выполнениянастоящей работы были клонированы и архивированы плазмиды с фрагментами геновAvi-mox (frkt#1292), Avi-evx (rk322, frkt#1293), Avi-piwi1 (pi-6, pi-49), Pdu-twist (frkt#1288),Pdu-mox (mo-50-2), Pdu-evx (frkt#1287), экспрессионные векторы с TALEN к Pdu-twist twi1L (frkt#1299), twi-1R (frkt#1300), twi-2L (frkt#1301), twi-2R (frkt#1302), twi-3L (frkt#1363),twi-3R (frkt#1364), а также репортерная трансгенная конструкция pTol{Avi-twist::eGFPF2A-NTR}. Регистрационные номера полноразмерных последовательностей геновинтереса в базе NCBI: Avi-twist – JN107993, Avi-mox – KU052761, Avi-evx – KU052760, Avivasa – KM406469, Avi-pl10 – KM406470, Avi-piwi1 – KM406471, Avi-piwi2 – KM406472.Для трансформации использовали химически компетентные клетки E.
coli OneShot TOP10 (Invitrogen) и XL1-Blue. ВАС-клоны, подвергавшиеся электропорации,относились к штамму E. coli DH10B.Культуры животныхНерестящихся эпитокных особей A. virens отлавливали в летний период вокрестностях Морской биологической станции СПбГУ на Белом море (Кандалакшскийзалив, губа Чупа). Лабораторную культуру зародышей получали с помощьюискусственногооплодотворенияпоотработаннойметодике(Дондуа,1975).Культивирование зародышей и личинок A. virens проводили при +14°С. Время развитияс момента оплодотворения приводится в часах после оплодотворения (чпо).РазмножающиесяP.dumeriliiкруглогодичносодержалисьвморскихаквариальных комнатах кафедры эмбриологии СПбГУ (линия дикого типа) и МФПЛУниверситета Вены (инбредные линии PIN, VIO, FL2, трансгенные линии tuba::egfpvbci1 иr-opsin::egfpvbci2).
Искусственное оплодотворение и культивирование зародышейпроводили при +18°С по опубликованной методике (Hauenschild, Fischer, 1969).Определение стадий развития A. virens и P. dumerilii проводили подмикроскопом на живом материале по опубликованным описаниям хронологииэмбриогенеза (Костюченко, Дондуа, 2006; Kulakova et al., 2007; Fischer et al., 2010). Вразвитии A. virens различали и фиксировали следующие стадии: 2–4 бластомера (7чпо), 8 бластомеров (8 чпо), 16 бластомеров (8 ч 40 мин), 17 бластомеров (9 ч 40 мин),23 бластомера (10 ч 30 мин), формирование соматобласта 4d (12–13 чпо), переход к69билатеральному дроблению (16 чпо), ранняя гаструла (18–20 чпо), поздняягаструла/протрохофора (31–32 чпо), ранняя трохофора (43 чпо), средняя трохофора(59–62 чпо), ранняя метатрохофора (90 чпо), средняя метатрохофора (113 чпо).
У P.dumerilii анализировали стадии начала формирования второго квартета микромеров(3,5 чпо), формирование соматобласта 4d и четвертого квартета микромеров (5 чпо),переход к билатеральному дроблению и формирование М-клеток (5,5 чпо), ранняягаструла (9 чпо), поздняя гаструла/протрохофора (16 чпо), ранняя трохофора (24 чпо),средняя трохофора (36 чпо), ранняя метатрохофора (48 чпо), нектохета (72 чпо и 96чпо).2.2. Манипуляции с живыми объектамиПрижизненные наблюденияДля прижизненных наблюдений объекты в морской воде помещали междупокровным и предметным стеклом с ножками из клейкой ленты. Чтобы предотвратитьиспарение воды, препарат запечатывали по контуру вазелиновым клеем илиминеральным маслом. Для иммобилизации личинок химических агентов неприменяли, высота ножек препарата подбиралась так, чтобы объекты оказывалисьнемного прижатыми к стеклу.МикроинъекцииПо протоколу Б.
Бэкфиша (Backfisch, 2013) в зиготы P. dumerilii инъецировалирастворы РНК и ДНК с помощью полуавтоматической системы, состоящей измикроманипулятора, инжектора и инвертированного микроскопа. Через 45 мин послеоплодотворения культуру развития отмывали от слизистой оболочки, промывая черезсито морской водой. Для размягчения желточной оболочки проводили обработкупротеиназой К (50 мкг/мл в морской воде в течение 25 сек). После перевариваниязародышей отмывали в 5 сменах свежей морской воды.
Объекты загружали напредварительносделаннуюагарознуюподложкуиконтролировалимикроманипуляции под 40х объективом. Раствор для инъекций содержал препаратыочищенной ДНК и/или РНК, KCl (40 мM) и окрашивающий агент – TRITC-декстран MW70 kDa (Invitrogen) (конечная концентрация – 0,6%) или феноловый красный (0,05%).Перед инъекциями раствор центрифугировали 4 мин при 11000 rpm для осаждениячастиц, способных закупорить микрокапилляры.70Инъекцииосуществлялиготовымикиспользованиюкоммерческимикапиллярами Femtotips II (Eppendorf). Инъекционное давление (pi) варьировало от 50до 300 гПа, компенсационное давление (pc) выставляли около 10 гПа, так чтобыобеспечить незначительное подтекание раствора.
Критичным для выживаемостизародышейбылидлительностьиобъеминъекции,которыеследоваломинимизировать.Ингибиторный анализМодуляцию MAP-киназного сигналинга проводили в растворе MEK-ингибитораU0126 (Promega) в период раннего развития A. virens – на стадиях дробления и началагаструляции (Рис.
54 А). Все варианты эксперимента повторяли не менее 3 раз напартиях зародышей от разных родителей. Порошок U0126 растворяли в DMSO доконцентрации 10 мM. Этот раствор хранили не более одного дня при -20°С. Финальнаяконцентрация ингибитора в морской воде составляла 40 µM. Для удаления слизистойоболочки зародышей промывали через сито для клеточных культур с ячеей 40 µ кислойморской водой (pH ~4).
Инкубацию с ингибитором или соответствующим количествомDMSO осуществляли в пластиковых чашках Петри в 6 мл раствора. Фиксацииконтрольных партий зародышей проводили в моменты начала и окончания действияU0126 в экспериментах (I)–(IV). На стадии ранней гаструлы (20 чпо) все объекты былиотмыты от ингибитора в 6 сменах морской воды.2.3. Молекулярно-биологические методыДизайн праймеровВырожденные праймеры подбирали к концам консервативных участков геновинтереса вручную. Для этого последовательности гомологов гена выравнивали поалгоритму BLASTP, используя пептиды полихет и моллюсков в качестве запроса.Выбранные аминокислотные области переводили в вырожденный нуклеотидный код.Дизайн геноспецифичных праймеров проводили с помощью on-line сервисаPrimer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
