Диссертация (1145742), страница 13
Текст из файла (страница 13)
dumerilii антитела к белку Vasa проявляют иммунореактивность вбластомере 4d и позднее – в происходящих из него клетках вторичного мезобласта,включая четыре ППК (Rebscher et al., 2007; Rebscher et al., 2012). Поскольку экспрессиямаркеров мультипотентности в мезодермальных полосках и эктомезодерме у нереидосталась неописанной, эта задача была включена в настоящую работу. Для более56полного понимания возможных функций данных генов интереса далее будут краткорассмотрены их характерные черты.Представители DEAD-бокс РНК-хеликаз (Vasa, PL10) характеризуются наличиемдевяти консервативных мотивов, один из которых – DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) – и далназвание семейству этих белков (Linder, 2006). Функция DEAD-бокс содержащих РНКхеликаз состоит в расплетении двухцепочечной РНК, что связана с разнообразнымипроцессамитрансляцией,метаболизмаРНК:деградациейитранскрипцией,поддержаниемсплайсингом,стабильноститранспортом,специфическихтранскриптов, биогенезом рибосом (Cordin et al., 2006).
По особенностям первичныхпоследовательностей выделяют несколько подгрупп DEAD-бокс РНК-хеликаз, вчастности, белки P68, подсемейство DDX3/PL10 и группу Vasa-подобных белков(DDX4/Vasa). Распространенный от бактерий до человека ген PL10, согласнофилогенетическомуанализу,являетсяанцестральнойпоследовательностью,дупликация которой произошла перед появлением губок и привела к возникновениюVasa, встречающемуся только у Metazoa (Mochizuki et al., 2001).Экспрессия гомологов Vasa и PL10 приурочена к малодифференцированным истволовым клеткам, хотя конкретные молекулярные пути поддержания стволовой сучастием DEAD-бокс РНК-хеликаз остаются непонятыми. Изначально ген Vasa былидентифицированудрозофилыкакматеринскийфакторпаттернированияпостериорных структур и спецификации первичных половых клеток (Schupbach,Wieschaus, 1986).
Обнаружение в детерминантах полового пути (полярных, половыхгранулах, нюаж, хроматоидных телах) и экспрессия гомологов Vasa в клетках половойлинии была показана для многих животных (Исаева и др., 2007; Extavour, Akam, 2003).Однако с накоплением наших знаний о DEAD-бокс РНК-хеликазах все чащепостулируется более широкая закономерность приуроченности их экспрессии именно кмультипотентному и малодифференцированному состоянию клетки (Juliano, Wessel,2010; Wu et al., 2011). Кроме того, функциональная необходимость гомологов PL10былавыявленажизнеспособностидляпочкованияколониальнойиличиночногоростаасцидиидрозофилы.BotryllusГомологиschlosseri,Vasaтакжеэкспрессируются в почках Botryllus schlosseri, в зоне деления олигохеты Pristinalongiseta (Костюченко и др., 2016), в клеточных источниках регенерации гонад посленереста устрицы, малых микромерах и рудименте дефинитивного тела (левом57гидроцеле) в развитии морского ежа, хвостовой почке ланцетника и ряде другихмультипотентных клеток (Gustafson, Wessel, 2010).Белки Piwi являются подгруппой семейства Argonaute – участников микроРНКопосредованного пути регуляции экспрессии генов (Cox et al., 1998).
Гомологи Piwiхарактеризуются наличием PAZ и PIWI доменов, первый из которых связывается с 3'концом особого класса микроРНК – piRNA, а второй гомологичен РНКазе Н и отвечаетза эндонуклеазную активность. Одной из первых установленных функций белков Piwiбыла защита генома клеток половой линии от экспансии транспозонов, однако позднеебыли получены данные об участии Piwi в регуляции транскрипции и трансляции(Thomson, Lin, 2009).ВажнымаспектомэкспрессиинекоторыхгомологовPiwiявляетсяихобнаружение в половых детерминантах (нюаж, полярная плазма), где ониколокализуются и физически взаимодействуют с Vasa, регулируя активность друг друга(Gustafson, Wessel, 2010). Подобно Vasa, экспрессия гомологов Piwi была найдена нетолько в развивающихся половых клетках, но и в ряде мультипотентных стволовыхэлементов губок, книдарий, гребневиков, плоских червей, асцидий (Reddien et al., 2005;Funayama et al., 2010; Alié et al., 2011; Juliano et al., 2011).
Следует особо отметить, чтофункциональный тест чаще всего выявляет необходимость Piwi для самоподдержанияи обновления таких клеточных популяций.***Некоторыегены,выполняющиеисключительноважнуюивесьмаконсервативную роль в сегментации тела артропод, были идентифицированы и уаннелид. Гомологи генов сегментации Delta, Notch, Hairy, Evx, Runx, Odd у червейимеют достаточно дифференциальные паттерны экспрессии с большим количествомдоменовв различныхзародышевыхлистках. Вместес тем, экспрессия вмезодермальных полосках, например, некоторых паралогов из суперсемейства Hairyподобных ТФ у Capitella и P. dumerilii говорит об эволюционно закрепленной функцииэтих генов (Thamm, Seaver, 2008; Gazave et al., 2014).
Ген Hairy является одной изканонических мишеней Delta/Notch-сигналинга. Поскольку сигнальные пути могутвовлекатьсявразнообразныеморфогенетическиепрограммыразвития,неудивительно, что его компоненты обнаруживаются в зачатках ЦНС, кишки,мезодермальных полосках и зоне роста у Capitella (Thamm, Seaver, 2008). Такжехорошо известно, что сам Hairy в пресомитной мезодерме позвоночных создает58транскрипционный осциллятор, чрезвычайно похожий на таковой с участием eve, runtи odd у артропод (Richmond, Oates, 2012).Гомологи hairy, eve, runt и odd функционально объединяются у насекомых подназванием “гены правила парности” и составляют наиболее консервативный модульпрограммы сегментации. Паттерны их экспрессии в мезодерме у зародышей и личинокCapitella проявляют признаки метамерности (Layden et al., 2010; Seaver et al., 2012),хотя указанные авторы склонны отрицать общность механизмов сегментации аннелиди артропод.
У других модельных объектов среди аннелид – пиявок – экспрессия Evxбыла приурочена к зародышевым полоскам, включая и эктодермальные, имезодермальные (Song et al., 2002). В то же время, транскрипция Evx полихеты P.dumerilii описана исключительно в эктодермальных производных (de Rosa et al., 2005).Безусловно, для сколько-нибудь уверенных выводов касательно роли обсуждаемыхгеноввразвитиимезодермыисегментациителааннелиднеобходимыфункциональные методы анализа и выяснение степени универсальности этойпрограммы развития на репрезентативной выборке объектов.1.3. Краткий обзор развития полихет как модельных объектовОбъектами нашего исследования послужили нереидные полихеты (сем.Nereididae) Alitta virens (M.
Sars, 1835) (ранее именовавшийся Nereis virens и Neanthesvirens) и Platynereis dumerilii (Audouin & Milne Edwards, 1834) (первоначальное название– Nereis dumerilii). Эти виды имеют длительную историю изучения, связанную сразличными отраслями биологии. Наиболее активно в данный момент исследуется ихразвитие и нейробиология, поскольку эти данные чрезвычайно актуальны дляэволюционных построений (Fischer, 1999; Fischer, Dorresteijn, 2004; Simakov et al., 2013;Williams, Jékely, 2016).Для Alitta virens и Platynereis dumerilii характерна семельпария – единственныйакт размножения, происходящий во время нереста (роения), после которого животныепогибают.
С такой жизненной стратегией связано производство огромного количествагамет. Нереиды выметывают в морскую воду тысячи ооцитов, которые послеоплодотворения претерпевают синхронное развитие вплоть до поздних личиночныхстадий (Рис. 12). Возможность получения столь удобного и объемного эмбриональногоматериала предопределила популярность нереид в качестве модельных объектов.59Рис. 12. Жизненный цикл P. dumerilii (Dorresteijn et al., 1993). Гаметы выметываются вморскую воду, где происходит оплодотворение, эмбриогенез и ларвальное развитие.Сферическая личинка трохофора имеет планктонный лецитотрофный образ жизни. Насмену ей в ходе плавного эволютивного метаморфоза приходят метамерные формы –метатрохофора и нектохета. Последняя оседает на дно и за счет анаморфного ростапревращается в бентосного многосегментного ювенильного червя. На завершающемэтапе онтогенеза происходит эпитокная трансформация, и половозрелые особипереходят к нересту в поверхностном слое воды, после чего погибают.Для Alitta virens и Platynereis dumerilii созданы таблицы нормального развития ирегенерации (Костюченко, Дондуа, 2006; Kulakova et al., 2007; Fischer et al., 2010; Козини др., 2017), существуют EST-библиотеки кДНК и геномные ВАС-библиотеки(https://bacpacresources.org/library.php?id=209).
У культивируемого в лабораторныхусловиях Platynereis dumerilii секвенированы, хотя большей частью и не опубликованы,геном и разнообразные транскриптомы (http://4dx.embl.de/platy; NCBI).Особенностиразвитияирепродукцииполихетпривлекаютинтересисследователей уже на протяжении более полутора столетий. Классическиеописательные работы Мечникова, Гатчека, Вильсона и др., вышедшие еще в 19-м веке,заложили основы нашего понимания онтогенеза и эволюции аннелид, а во многомактуальны и по сей день (Wilson, 1892).
Следующее поколение эмбриологов (Лилли,Чайлд, Иванов, Костелло) широко применяло экспериментальный подход, что помогловскрыть внутренние закономерности развития аннелид в норме и при регенерации(Iwanoff, 1928; Costello, 1945). При этом были обоснованы фундаментальные проблемы60детерминации,дифференцировки,морфогенезаиэволюциимногоклеточныхживотных.Что же обеспечило такую популярность кольчатых червей и плодотворность ихизучения? Прежде всего, стоит отметить близость ряда групп (в первую очередьэррантных полихет) канцестральному состояниюBilateria. Консервативнымипризнаками, унаследованными от общего предка билатеральных животных, принятосчитать раннекембрийское происхождение, обитание в морской среде, план строениясегментированного тела, амфистомию, определенный набор семействгенов,соотношение паттернов их экспрессии и ряд особенностей организации генома. Какбыло выяснено, все эти черты ярко выражены у нереидных полихет, что связывают смалой скоростью их эволюции (Raible et al., 2005; Zantke et al., 2014).
Нереид частоназывают “живыми ископаемыми”, подчеркивая их преимущества над хорошоразработанными, но эволюционно продвинутыми модельными объектами средибеспозвоночных – дрозофилой, нематодой C. elegans, асцидией Ciona, которыенезависимо утратили некоторые древние признаки, сохранившиеся в измененномсостояниидажеупозвоночных.Такаяситуацияделаетнереидболеепредпочтительным объектом для изучения в сравнительном аспекте.В филогенетической системе аннелид нереиды относятся к кладе Errantiaпарафилетического класса Polychaeta (Struck et al., 2011).
Среди полихет насчитываетсядо 10000 видов, сгруппированных примерно в 80 семейств. Это почти исключительноморскиеживотные,являющиесянаиболеедревнимииразнообразнымипредставителями типа Annelida. Эмбриональное развитие полихет проходит поспиральномутипу,врезультатекоторогообычнообразуетсяпланктоннаянесегментированная личинка трохофора. Следует отметить, что этапы дробления,гаструляции и личиночных органогенезов часто накладываются друг на друга. Телотрохофорывпроцессеметаморфозаразделяетсянасегменты,именуемыеларвальными. Далее, из субтерминальной зоны роста ювенильного червя начинаютобразовываться постларвальные сегменты (Иванова-Казас, 1977; Anderson, 1973).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
