Диссертация (1145742), страница 19
Текст из файла (страница 19)
После фиксации объекты переводили в 70%этанол и хранили при -20°С.Для иммуноцитохимического выявления активной (дифосфорилированной)формы MAP-киназы (dpErk1/2) материал регидратировали в спиртах понижающейсяконцентрации (по 5 мин в 50% и 25% этаноле) и промывали 5 раз по 5 мин в PBT (1xфосфатный буфер PBS pH 7,4 + 0,1% Triton X-100 + 0,1% азид натрия). Дляпермиабилизации желточной оболочки объекты переваривали протеиназой К (100мкг/мл при +22°С в течение 30 сек), после чего отмывали в 2 быстрых сменах глицинана PBT (2 мг/мл) и 5 сменах PBT. Забивку проводили 2 ч в 5% овечьей сыворотке на PBT.Инкубация в первичных антителах в 2,5% сыворотке на PBT продолжалась 1–2 дня при+4°С.
После отмывок в PBT (6 раз в течение как минимум 2 ч) добавляли растворфлуоресцентных вторичных антител. Использовали следующие разведения антител:1:100 rabbit anti-Phospho-p44/42 MAPK (Cell Signaling #4370), 1:2000 mouse anti-α-tubulin(Sigma T5168), 1:200 mouse anti-β-tubulin (Sigma T4026), 1:400 AF488-conjugated antirabbit (Invitrogen A11034), 1:400 Cy5-conjugated anti-mouse (Jackson ImmunoResearch715-175-150). Отмывки от вторичных антител сочетали с окрашиванием ядерной ДНК вDAPI (Sigma) в течение 1–2 ч. Объекты пропитывали в 90% глицерине с 10% PBT ихранили при -20°С.Гибридизация in situВкачествематрицыдлясинтезамеченыхРНК-зондовиспользоваликлонированные фрагменты генов Avi-twist (клон rk155, 3’RACE-фрагмент длиной ~1,2kb), Avi-mox (клон frkt#1292, 5’RACE-фрагмент длиной ~1,0 kb), Avi-evx (клон frkt#1287,3’RACE-фрагмент длиной ~1,7 kb), Avi-vasa (клон rk235, 5’RACE-фрагмент длиной ~1,6kb), Avi-pl10 (клон rk263, 5’RACE-фрагмент длиной ~1,8 kb), Avi-piwi1 (клон rk229,3’RACE-фрагмент длиной ~1,3 kb), Avi-piwi2 (клон rk232, 3’RACE-фрагмент длиной ~1,2kb).Плазмиды выделяли из бактериальных клеток (клонов) набором JETQUICKPlasmid Miniprep Spin Kit (Genomed) по протоколу производителя, растворяли в воде,определяли концентрацию на спектрофотометре.
Линейную форму фрагмента гена(матрицу для транскрипции in vitro) получали путем рестрикции или ПЦР.88Электрофорезом в агарозном геле проверяли длину полученного линейногофрагмента, который затем очищали китом QIAquick PCR purification kit (Qiagen). Спомощью транскрипции in vitro синтезировали меченные дигоксигенином (DIG) РНКзонды. Реакцию объемом 20 мкл собирали на льду, последовательно добавляяследующие компоненты (Roche):H2O (RNAse free)х µlДНК-матрица (0,5–1 µg)12 µl max10x буфер2 µlDTT (100 mM)2 µlNTP/DIG-UTP-Mix2 µlRNase inhibitor1 µlРНК-полимераза1 µlИТОГО20 µlВ зависимости от ориентации вставки использовали T7 или Sp6 РНК-полимеразу(Roche). После 4–12 ч инкубации при +37°С в реакцию добавляли 1 мкл ДНКазы I(Roche), инкубировали еще 15 мин, а затем выделяли продукт китом RNeasy Mini Kit –RNA clean up (Qiagen).
РНК-зонд элюировали в 50 мкл безРНКазной воды и проверяликачество продукта электрофорезом в агарозном геле (аликвоту РНК предварительноденатурировали в формамид-содержащем буфере 5–10 мин при +80°С).Зародышей и личинок A. virens концентрировали в сите для клеточных культур сячеей 40 µ и фиксировали в течение ночи при +4°С в 4% формалине на 1,75х фосфатномбуфере с 0,1% Tween 20. Затем фиксации переводили в этиловый или метиловый спирти хранили при -20°С.
Молекулярная гибридизация in situ на тотальных препаратах(whole mount in situ hybridization, WMISH) была проведена в соответствии сопубликованным протоколом (Tessmar-Raible et al., 2005). Принцип WMISH состоит ввыявленииспецифическойкомплементарнымэндогеннойантисмысловымРНКРНК-зондом,спомощьюпомеченнымгибридизацииантигеномсDIG.Фиксированные образцы переводили в водную фракцию, проводя по градиентуспиртов (75%, 50%, 25% метанол на PTW (1x фосфатный буфер PBS pH 7,4 с 0,1% Tween20)) до PTW, обрабатывали протеиназой К (100 мкг/мл при +22°С в течение 0,5–1 мин),постфиксировали и инкубировали 1–12 ч в гибридизационном буфере (50% формамид,5x SSC, 50 мкг/мл гепарин, 5 мг/мл Torula-RNA, 0,1% Tween 20). После гибридизации сРНК-зондом, проходящей при +65°С 1–2 дня, и отмывки в 2x SSC с 50% формамидом, 2x89SSC и 0,2x SSC, производили забивку образцов и антител в 5–2,5% овечьей сыворотке(1–2 ч). Инкубацию с антителами против DIG, конъюгированными с ферментомщелочная фосфатаза (Digoxigenin-AP Fab fragments, Roche), проводили в течение ночипри +4°С.
За отмывкой от антител в PTW в течение 1,5–2 ч и переводом в щелочнойбуфер (pH 9,0) следовал этап окрашивания (проявки) в растворе субстрата BCIP/NBT(Roche). При этом щелочная фосфатаза вырабатывает цветной нерастворимый продуктреакции, детектируемый на клеточном уровне. Окрашенные объекты отмывали отсубстрата и пропитывали 90% глицерином для дальнейшего микроскопическогоанализа.В некоторых случаях WMISH сочеталась с методом иммуноцитохимии.Первичные антитела к ацетилированному α-тубулину (Sigma) добавляли к антителампротив DIG, а вторичные, меченые FITC (Sigma), – после цветной реакции (проявки) ссубстратом BCIP/NBT. После гибридизации in situ проводили дополнительноеокрашивание ядерной ДНК флуоресцентным маркером DAPI.Методы микроскопии и работа с изображениямиРезультаты гибридизации in situ, иммуноцитохимии и экспериментов потрансгенезу обрабатывали при помощи световой, флуоресцентной и лазернойконфокальной микроскопии.
При изучении образцов на светооптическом уровнеприменяли метод дифференциального интерференционного контраста (DIC, оптикаНомарского). При этом делали серию снимков в разных фокальных плоскостях. Дляотображения всех доменов экспрессии эти снимки иногда объединяли в программахImageJ и Adobe Photoshop CS 5.1. Выявление сигнала BCIP/NBT на конфокальноммикроскопе проводили по опубликованным рекомендациям (Jékely, Arendt, 2007).Конфокальные изображения анализировали и создавали максимальные Z-проекции впрограммах ImageJ и LAS AF Lite (Leica Microsystems). Иллюстрации редактировали вMicrosoft Publisher 2010 и Adobe Illustrator CS 5.1.Для морфометрического анализа длины МП на изображениях распределениямРНК Avi-twist с помощью программы AxioVision 4.8 измеряли расстояние повентральной медианной линии (Рис. 55).
В программах STATISTICA 10 (StatSoft) иMicrosoft Excel 2010 рассчитывали среднее, дисперсию и 95% доверительный интервал(n=18).Статистическуюзначимостьотличийпроверялидисперсионным анализом (ANOVA тест) и Post-hoc тестом.90однофакторнымГлава 3. Результаты3.1. Анализ структурно-функциональной организации и экспрессиигенов интересаВнастоящейработедляполихетыA.virensбыликлонированыипроанализированы фрагменты генов Twist, Mox, Evx, Vasa, PL10 и Piwi, гомолог Twistбыл также идентифицирован и отклонирован для P.
dumerilii (Рис. 17, Таблица 1). Изпросеквенированных участков кДНК и гДНК были восстановлены полноразмерныепоследовательности, содержащие предполагаемые 5’ UTR, протяженные ORF и 3’ UTRдля генов Twist, Evx, Vasa, и Piwi. В связи с техническими трудностямипоследовательности Mox и PL10 остались неполными на 3’ конце. У обеих полихетбыло обнаружено по два паралогичных гена Piwi (Piwi1 и Piwi2), для остальных геновудалось найти по одному гомологу. Впервые идентифицированные гены A.
virens былиназваны Avi-twist, Avi-mox, Avi-evx, Avi-vasa, Avi-pl10, Avi-piwi1 и Avi-piwi2; Twistнереиды P. dumerilii был описан ранее под названием Pdu-twist (Pfeifer et al., 2013).Рис. 17. Строение транскриптов проанализированных генов интереса. Зеленымиблоками отмечена некодирующая часть (UTR), белок-кодирующая область (CDS)91выделена оливковым, вертикальные линии внутри блоков маркируют границыэкзонов. Красные блоки показывают участки, кодирующие в белке консервативныедомены.
Цифрами обозначена длина последовательности кДНК.Таблица 1. Основные структурные характеристики исследованных генов. Единицаизмерения – bp.гендлина5’ UTRдлина длинаCDS3’ UTRAvitwistдлинакДНК/гДНК1529/6060длина количество ибелка длинаинтронов2041 интрон:453131615883Pdutwist1890/~9000486691173Avimox347>672нет>224данныхнет данныхAvievxAvivasa>1019/нетданных2305/ нетданных2676/165822 экзона:от 653 (№1) до876 (№2)2 экзона:от 724 (№1) до1166 (№2)нет данных2301251824416нет данныхнет данных1322427117808Avipl10>2366/>10394562310нет769данныхAvipiwi13538/17594102261082686919 интронов:от 80 bp (№4)до 5249 bp(№2)14 интронов:от 111 (№8)до 1974 (№3)15 интронов:от 82 (№6) до7075 (№1)Avipiwi23566/1424069285664195120 экзонов:от 15 (№12), 26(№4) до 310(№16)15 экзонов:от 61 (№2) до322 (№7)16 экзонов:от 177 (№1) до943(последний№16)19 экзонов:от 56 (№17), 58(№1) до 731(последний№19)222921 интрон:~700018 интронов:от 87 (№18),90 (№7) до7123 (№1)количество идлина экзонов3.1.1.
TwistПредоставленныефрагментыгомологаTwistуA.virensсоставляютпоследовательность длиной 1529 bp, соответствующий клонированный ген P. dumerilii(по данным геномной и транскриптомной базы http://4dx.embl.de/platy – этоединственный ортолог) состоит из 1890 bp. Геномный локус Twist занимает около 6 kb вгДНК A. virens и около 9 kb – в случае P. dumerilii. Гомологи Twist этих полихетпредставлены двумя экзонами и одним протяженным интроном (Рис. 18). Первыйэкзон состоит из 5’ UTR (длиной 31 bp у A. virens и 48 bp – у P. dumerilii), ORF,соответствующейбелок-кодирующимпоследовательностям(CDS)Twistдругихживотных (615 bp у A.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
