Диссертация (1145742), страница 22
Текст из файла (страница 22)
31 Н, П). Кроме того, Avi-evx экспрессируется в некоторыхповерхностных и субэпителиальных клетках, метамерно расположенных по бокам телаи находящихся в тесной связи с хетоносными мешками (Рис. 31 О–Р).3.1.4. Vasa и PL10Изученные гомологи генов, кодирующие DEAD-box хеликазы Vasa и PL10,составлены у A. virens в кДНК из 2676 bp и 2366 bp, соответственно. Геномный локусAvi-vasa занимает около 17 kb и состоит из 20-ти экзонов длиной от 15 bp (экзон 12) до310 bp (экзон 16) (Рис. 32 А). Из 19-ти интронов наименьшую длину имеет интрон 4 (80bp), наибольшую – интрон 2 (5249 bp). 5’ UTR (длиной 132 bp) закодирована в 1-м и 2-мэкзонах; экзоны со 2-го по 20-й содержат ORF (длиной 2427 bp), соответствующую CDSVasa других животных; 3’ UTR (длиной 117 bp) занимает часть последнего (20-го)экзона.Рис. 32.
Геномные локусы генов Vasa, PL10 и Piwi у A. virens. Экзоны обозначеныкоричневыми блоками, белок-кодирующая область выделена оливковым. Цифрамиобозначена длина последовательности гДНК в bp.Локус Avi-pl10 в гДНК простирается более чем на 10 kb, в нем закодировано 15экзонов длиной от 61 bp (экзон 2) до 322 bp (экзон 7) и 14 интронов длиной от 111 bp(интрон 8) до 1974 bp (интрон 3) (Рис.
32 Б). Первый экзон кодирует 5’ UTR (длиной 56bp) и начало ORF, содержащейся также во всех последующих экзонах. Найденная ORF(общей длиной 2310 bp) соответствует CDS PL10 других животных и оканчивается стопкодоном. Часть гена Avi-pl10, содержащую 3’ UTR клонировать нам не удалось. Сходное106количество экзонов описано для гомологичных генов позвоночных и Anthozoa, тогдакак у представителей Ecdysozoa этот показатель ниже в два раза и более.Рис.
33. Строение предполагаемых белковых продуктов Vasa и PL10 у A. virens.Фиолетовыми блоками выделены консервативные домены ZF, DEAD и Hel C. Цифрамиобозначена длина последовательности в аминокислотных остатках.Рис. 34. Филогенетическое древо аминокислотных последовательностей Vasa и PL10 пометоду максимального правдоподобия (Maximum likelihood). Для каждойпоследовательности приведен буквенно-цифровой код из базы NCBI. Оценкастатистической достоверности узла на основе aLRT обозначена цифрами.
Шкала вколичестве замен на позицию.Предполагаемые белковые последовательности Avi-vasa и Avi-pl10 состоят из808 аа и 769 аа, соответственно. У обоих белков выявлены консервативные участки:хеликазный DEAD/DEAH-box и С-концевой хеликазный домен (Рис.
33). Кроме того,ближе к N-концу Avi-vasa содержит 6 цинк-фингерных мотивов CCHC-типа.Филогенетический анализ подтвердил, что хеликазы Avi-vasa и Avi-pl10 являются107представителями подсемейств DDX4/Vasa и DDX3/PL10, соответственно (Рис. 34). Восновании каждого из этих кластеров находятся последовательности актинииNematostella, также в обоих кластерах можно выделить группы последовательностей,принадлежащих одним и тем же представителям (1) позвоночных, (2) насекомых и (3)спиралий. В последней из групп и в случае гомологов Vasa, и в случае PL10 происходитчеткое разделение генов моллюсков и генов полихет. В целом, для гомологов PL10характерна меньшая длина ветвей, чем у Vasa, что говорит о наибольшем числе заменна позицию и, следовательно, наибольшей степени дивергенции подсемействаDDX4/Vasa по сравнению с подсемействами DDX3/PL10 и DDX5/p68.
В пределахкластеровDDX3/PL10иDDX4/Vasaнаименьшейдлинойветвейобладаютпоследовательности спиралий, наибольшей – насекомых.Результаты гибридизации in situ показали, что во время раннего развития геныAvi-vasaиAvi-pl10экспрессируютсяпочтиповсеместно.Первыепризнакидифференциальной экспрессии были выявлены со стадии ранней трохофоры (Рис. 35,36).Рис. 35. Экспрессия Avi-vasa в начале ларвального развития.
Гибридизация in situ, DIC.А–В – ранняя трохофора (43 чпо); Г–Е – средняя трохофора (59 чпо); Ж–И – ранняя108метатрохофора (90 чпо). А, Г, Ж – вентральная проекция; Б, Д, З – вентральнаяпроекция, глубокая фокальная плоскость; В, Е, И – латеральная проекция, дорсальнаясторона справа.
Энтомезодерма (мезодермальные полоски) отмечена оранжевымпунктиром, экспрессия в них показана белыми стрелками, экспрессия в основании МП(во вторичном мезобласте) – прозрачным треугольником, экспрессия в эктомезодерме– оранжевыми треугольниками, экспрессия в эктодерме – синими треугольниками, Х –вегетативный полюс (область проктодеума), звездочка – область стомодеума.Масштаб 25 мкм.Рис. 36.
Экспрессия Avi-pl10 в начале ларвального развития. Гибридизация in situ, DIC.А–В – ранняя трохофора (43 чпо); Г–Е – средняя трохофора (59 чпо); Ж–И – ранняяметатрохофора (90 чпо). А, Г, Ж – вентральная проекция; Б, Д, З – вентральнаяпроекция, глубокая фокальная плоскость; В, Е, И – латеральная проекция, дорсальнаясторона справа. Энтомезодерма (мезодермальные полоски) отмечена оранжевымпунктиром, экспрессия в них показана белыми стрелками, экспрессия в эктомезодерме– оранжевыми треугольниками, экспрессия в эктодерме – синими треугольниками, Х –вегетативный полюс (область проктодеума), звездочка – область стомодеума.Масштаб 25 мкм.У трохофорных личинок транскрипты Avi-vasa и Avi-pl10 детектируются впокровном эпителии гипосферы (Рис.
35 А, Б, Г,36 А–Г), в случае Avi-vasa –преимущественно на вентральной стороне, в формирующейся вегетативной пластинке,а в случае Avi-pl10 – как на вентральной, так и на дорсальной стороне, выполненной109более уплощенными эпидермальными клетками. Стоит отметить, что чаще всегосигнал мРНК обоих генов отсутствует в области презумптивного проктодеума,расположенного на вегетативном полюсе. Во всем эпителии эписферы трохофор иметатрохофор широко экспрессируется Avi-pl10 (Рис. 36 Б, В, Е, Ж), тогда кактранскрипты Avi-vasa обнаруживаются лишь в отдельных доменах (Рис.
35 Б, В, Д, Е,Ж).В области стомодеума в равной степени присутствует экспрессия Avi-vasa и Avipl10. Для стадии ранней трохофоры характерны картины локализации мРНК врасположенной ближе к вегетативному полюсу стомодеальной пластинке (с моментаее формирования) (Рис. 35 А, В, 36 А, В). У средних трохофор и ранних метатрохофорэкспрессия Avi-vasa и Avi-pl10 также сопровождает развивающийся зачаток переднейкишки, переместившийся ближе к экватору и претерпевший инвагинацию (Рис. 35 Г, Ж,36 Г, Ж).
Непосредственно к стомодеуму примыкают Avi-vasa-положительные и Avipl10-положительные клетки эктомезодермы. На стадии ранней трохофоры экспрессияAvi-vasa и Avi-pl10 обнаружена в крупных немногочисленных эктомезодермальныхклетках по бокам стомодеальной пластинки и непосредственно над ней – в группемелких клеток той же природы (Рис.
35 А, 36 А). У средней и поздней трохофорыколичество эктомезодермальных клеток увеличивается, происходит их реаранжировка,и к стадии ранней метатрохофоры трехчастный домен вокруг стомодеумаобъединяется в полукольцо (Рис. 35 Ж, 36 Ж), а затем – в замкнутое кольцо.Вторая часть мезодермального зачатка – энтомезодерма – экспрессируетгомологи Vasa и PL10 заметно сильнее, чем другие компартменты тела личинки. мРНКAvi-pl10 распределена по длине каждой МП равномерно (Рис. 36 Б–Е), тогда как Avivasa сильнее экспрессируется в ее задней части (Рис.
35 Б–Е). На стадии раннейметатрохофоры Avi-pl10 продолжает весьма обильно экспрессироваться латерально вбольшинстве глубинных клеток гипосферы, среди которых весьма вероятноприсутствуют энтомезодермальные элементы (Рис. 36 Ж–И). Паттерн экспрессии Avivasa становится на этой стадии гораздо более дифференциальным: сигнал мРНКвыявляется в билатерально-симметричных метамерных группах внутренних клеток,примыкающих к хетоносным мешкам (Рис. 35 З–И). Автор связывает эти доменыэкспрессии Avi-vasa с зачатками параподиальных мышц, в которых более масштабноэкспрессируется Avi-twist.110На вегетативном полюсе, в месте соединения МП, расположенном кпереди отобласти проктодеума, был выявлен отдельный внутренний домен сильной экспрессииAvi-vasa и Avi-piwi1, состоящий на протяжении всего развития трохофоры из порядка 6–8 мелких клеток (Рис.
35 Б, Д, 39 Б, Е). Наиболее вероятно, что этот клеточныйкомпартмент (по месту локализации в теле трохофоры, размерам и количеству клеток)соответствует описанному Вильсоном (Wilson, 1892; Wilson, 1898) для нереиды Nereislimbata т.н. вторичному мезобласту (группа наиболее ранних мелких потомков Мклеток). У ранних метатрохофор соответствующий домен экспрессии Avi-vasa и Avipiwi1 заметно расширяется и все так же обладает наибольшей интенсивностью сигнала(Рис. 35 З, И, 39 К, Л).3.1.5. PiwiДва изученных гомолога Piwi A. virens, названные Avi-piwi1 и Avi-piwi2,представлены в кДНК последовательностями длиной 3538 bp и 3566 bp,соответственно. Геномный локус Avi-piwi1 (Рис.
32 В) занимает около 18 kb,представляя собой 16 экзонов длиной от 177 bp (экзон 1) до 943 bp (последний 16-йэкзон). Локус Avi-piwi2 (Рис. 32 Г) заметно короче – около 14 kb, состоит из 19 экзоновдлиной от 56–58 bp (17-й и 1-й экзон, соответственно) до 731 bp (последний 19-йэкзон). Наиболее протяженным у обоих генов является 1-й интрон (7075 bp у Avi-piwi1 и7123 bp у Avi-piwi2), наименьшим интроном у Avi-piwi1 является 6-й (82 bp), у Avi-piwi2– 18-й (87 bp). У обоих генов 5’ UTR (длиной 102 bp у Avi-piwi1 и 69 bp у Avi-piwi2)содержится в 1-м и 2-м экзоне. 2-й и последующие экзоны кодируют ORF (длиной 2610bp у Avi-piwi1 и 2856 bp у Avi-piwi2), соответствующую CDS Piwi других животных.Протяженная 3’ UTR (длиной 826 bp у Avi-piwi1 и 641 bp у Avi-piwi2) занимает большуючасть последнего экзона.Предполагаемые белки Avi-piwi1 и Avi-piwi2 состоят из 869 аа и 951 аа,соответственно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
