Диссертация (1145742), страница 26
Текст из файла (страница 26)
(an) – анафаза;(met) – метафаза.130Следующая исследованная стадия 23-х бластомеров появляется после того, какеще шесть клеток завершают пятое деление дробления. Потомки всех микромеровпервого квартета демонстрируют сходный паттерн активности Erk1/2 во всехквадрантах: сигналинг активирован в клетках 1q11 и 1q12, но выключен в клетках 1q2(Рис. 53 Г–Г’’, Таблица 2).
В микромерах второго квартета 2a, 2b и 2c интенсивностьсигнала dpErk1/2 существенно падает, тогда как в ядрах сестринских клеток 2d1 и 2d2интенсивный сигнал dpErk1/2 появляется впервые. Активность MAP-киназногосигналинга также была обнаружена в единственных сформированных к этому моментумикромерах третьей генерации 3c и 3d, а кроме того – в макромер 3D (Рис. 53 Г–Г’’,Таблица 2). В остальных макромерах – интерфазном 3C и все еще делящихся 2A и 2B –активной формы Erk1/2 выявлено не было.В ходе дальнейшего развития A. virens сигнал dpErk1/2 становится существеннослабее.
В конце пятого клеточного цикла (зародыш из порядка 32 бластомеров)активность MAPK-сигналинга отмечается, хотя и на незначительном уровне, вбольшинстве интерфазных клеток, включая макромеры 3A–3D. На завершающих этапахдробления лишь очень слабый (на границе разрешающей способности конфокальногомикроскопа) сигнал dpErk1/2 выявляется в ядрах потомков соматобластов – М-клетках,2d11, а также в некоторых анимальных микромерах (Рис. 53 Д–Д’’).3.3.2.
Ингибиторный анализДля оценки функции MAPK-сигналинга в раннем развитии A. virens былпоставлен эксперимент со специфическим ингибитором MAPKK – U0126 –фармакологическим агентом, блокирующим фосфорилирование MAP-киназы Erk1/2повсеместно. Начало воздействия U0126 соответствовало периоду дробления, вовремя которого была обнаружена активная форма Erk1/2 – со стадий восьми, 16-ти, 17ти бластомеров и после формирования соматобласта 4d – эксперименты (I), (II), (III) и(IV), соответственно (Рис.
54). Во всех вариантах эксперимента действие блокаторабыло снято на стадии ранней гаструлы (20 чпо). Анализу подвергли личинок в возрасте62 чпо, достигших в контроле стадии средней трохофоры, и средних метатрохофор (113чпо).Во всех экспериментах у прижизненно изученных личинок наблюдаласьбилатеральная симметрия тела: присутствовали правильно расположенные глаза,131стомодеум, хетоносные мешки. Трохофоры плавали с помощью ресничек прототроха,однако у объектов из экспериментов (I), (II) и (III), в отличие от контроля, отсутствовалфототаксис, а также наблюдалось полное или частичное отсутствие пигмента впрототрохе. У всех метатрохофор, кроме контрольных, отсутствовали мышечныесокращения, гипосфера была несколько укорочена и иногда аномально загнута вперед.Рис.
54. Влияние ингибитора МАРК-сигналинга U0126 на развитие мезодермы у A.virens. А – схема экспериментов (I), (II), (III), (IV). Стадии развития подписаны нагоризонтальной временной оси сверху, периоды обработки ингибитором отмеченыкрасным. Все объекты были проанализированы на стадии средней трохофоры(крестики) и показаны на Б–Л – гибридизация in situ, DIC, вентральная проекция.Экспрессия Avi-twist (Б–Е) и Avi-mox (Ж–Л) в разных вариантах эксперимента и контроле(подписано сверху).
В результате экспериментов (I), (II), (III) энтомезодермадемонстрирует экспрессию Avi-twist и Avi-mox, но ее морфогенез существенно нарушен– отмечено прозрачной стрелкой. В эксперименте (IV) и контроле наблюдаетсянормальный метамерный паттерн экспрессии – черные стрелки. Звездочка – областьстомодеума.
Масштаб 25 мкм.Для более детального анализа влияния U0126 на развитие мезодермы утрохофор были изучены паттерны экспрессии мезодермальных генов-маркеров Avitwist и Avi-mox. Результаты гибридизации in situ показали, что мезодермальныйматериал формируется даже при самом раннем подавлении МАР-киназногосигналинга. У всех объектов из всех экспериментов с U0126 были выявлены132эктомезодермальные домены экспрессии Avi-twist и Avi-mox, расположенные вблизистомодеума. Энтомезодермальные Avi-twist-положительные и Avi-mox-положительныеклетки также были обнаружены у всех личинок, однако организация этих доменовсильно отличалась в различных вариантах эксперимента по подавлению MAPKсигналинга (Рис. 54).У личинок из экспериментов (I), (II) и (III) строение и форма МП быласущественно нарушена. Вместо нормального метамерного паттерна экспрессии Avitwist и Avi-mox в энтомезодерме на вегетативном полюсе личинок наблюдалисьдомены экспрессии в плотных клеточных конгломератах или в деформированных МП,сильно укороченных вдоль переднезадней оси (Рис.
54). У трохофоры из эксперимента(IV), в котором ингибитор U0126 применялся после деления бластомера 3D, видимыхотличий в экспрессии Avi-twist и Avi-mox по сравнению с контролем отмечено не было.Рис. 55. Сравнение длины мезодермальных полосок у трохофор A. virens в норме ипосле воздействия ингибитором U0126.
На фото справа изображена экспрессия Avitwist в контрольном эксперименте, вентральная проекция, оранжевый треугольник –эктомезодермальный сигнал. Белой стрелкой обозначен анализированный показатель– расстояние в микронах по срединной линии между передней и задней границейэкспрессии Avi-twist в энтомезодерме. На гистограмме отмечено среднее значениедлины МП (n=18) у объектов из экспериментов (I), (II), (III), (IV) и в контроле (подписанона оси абсцисс).
В качестве планок погрешности приведены значения 95%доверительного интервала. Звездочкой обозначено достоверное отличие от контроля.Длина МП в эксперименте и контроле была измерена, как показано на Рис. 55,после чего производилась статистическая обработка морфометрических данных. Внорме длина МП вдоль переднезадней оси составляет в среднем 76 µ. По результатамдисперсионного анализа (ANOVA тест) было показано достоверное влияние фактора133(длительность воздействия U0126) на длину МП у трохофор (p=2,9*10-24). Нагистограмме (Рис. 55) можно наблюдать положительный тренд анализируемогопараметра в ряду экспериментов (I)–(IV). Post-hoc тест показал, что статистическизначимые различия (p<0,05) отсутствуют между выборками (II) и (III), и междувыборками (IV) и “контроль”.
При этом длина МП у объектов из экспериментов (I), (II) и(III) достоверно отличается от таковой в контроле (она меньше на 44%, 32% и 30%,соответственно).Таким образом, можно уверенно говорить о нарушении морфогенеза МП у A.virens при ранней блокаде МАРК-сигналинга (критический период – до формированиясоматобласта 4d). В то же время наличие экспрессии мезодермальных маркеров ибилатеральной симметрии тела у экспериментальных объектов свидетельствует впользу существования МАРК-независимых механизмов спецификации энтомезодермыи дорсовентральной оси у исследованного вида.134Глава 4.
Обсуждение результатов4.1. Молекулярные регуляторы развития мезодермы нереид ииспользуемые методические подходы для их анализаПолучение принципиально новых данных невозможно без совершенствованияметодовисследования.Наиболееактуальнымиплодотворнымподходомсовременной биологии развития является изучение молекулярно-генетическогоконтроляморфогенетическихфункциональногоанализа.процессовИзначальноспомощьюприжизненногоопределяютсягеныиинтереса,предположительно имеющие связь с изучаемым предметом. В настоящей работе быловыбрано и выделено 8 таких генов (Avi-twist, Pdu-twist, Avi-mox, Avi-evx, Avi-vasa, Avipl10, Avi-piwi1, и Avi-piwi2), проведен их филогенетический анализ, выявлена экзонинтроннаяидоменнаяорганизация,установленаихмезодермальнаятканеспецифичность.По построенным филогенетическим схемам можно судить, что для генов нереидв целом характерна малая длина ветвей, что отражает малую степень дивергенцииэтих последовательностей (Kozin, Kostyuchenko, 2015; Kozin et al., 2016).
Топологиядендрограмм Mox, Vasa, PL10 и Piwi показывает совместную кластеризацию гомологовSpiralia, на основе чего можно предположить большее единообразие (консерватизм)их первичной последовательности и выполняемой функции. Экзон-интронная идоменная структура изученных генов проявляет большой консерватизм – присутствуютхарактерныедля каждогосемействафункциональныедомены; комплексноеустройство генов с множеством экзонов отвечает анцестральному для Metazoa типуорганизации генома (Raible et al., 2005; Putnam et al., 2007).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
