Диссертация (1145742), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Особенно ярко последняяхарактеристика прослеживается у гомологов Vasa, PL10 и Piwi, насчитывающих у A.virens от 15 до 20 экзонов. Около 20 экзонов содержится в соответствующих генахчеловека и актинии Nematostella, тогда как у дрозофилы их всего 4–8.Консерватизм кодирующей части генов, тем не менее, не обеспечиваетуниверсальности выполняемых функций.
Как выяснилось, исследованные геныинтереса вовлечены в различные аспекты развития мезодермы. Значительнаяфункциональная вариабельность присутствует и между гомологами из одногогенетического семейства у разных организмов (Таблица 3). Например, у A. virens Twistявляется ранним панмезодермальным маркером, а у моллюсков работает только в135эктомезодерме. Причины тому следует искать в вышестоящих управляющихмеханизмах – в наборе цис-регуляторных элементов и связывающихся с ними трансфакторах.Таблица 3.
Мезодермальные регуляторные факторы у полихет и брюхоногихмоллюсковОрганизмTwistMoxGATAAlitta virens,Platynereis dumerilii(сем. Nereididae,Errantia)энтомезод,эктомезод,ЗР*энтомезод,эктомезод,ЗР*энтомезод,эктомезодCapitella teleta(Sedentaria)энтомезод,эктомезод,ЗР?Patella vulgata,Testudinaliatestudinalis(Patellogastropoda)Haliotis asinina(Vetigastropoda)эктомезод?Ilyanassa obsoleta(Caenogastropoda)??энтомезод?Vasaэнтомезод,эктомезод,эктод,энтод,ППК, ЗР*энтоэнтомезод, мезод,эктоэктомезод, мезод?,кишка, эктод,ЗРППК, ЗР????энтомезод,эктодэнтомезод,ППКPL10Nanosэнтомезод,эктомезод,эктод,энтод,ЗР*?энтомезод,эктомезод,эктод,энтод,ППК, ЗРэнтомезод,эктомезод?,эктод,ППК, ЗР?энтомезод,эктод,ЗР*энтомезод,эктодэнтомезод,ППК??энтомезод,эктод?Evxэнтомезод,эктод,кишка,ЗР??Тканеспецифичность экспрессии на уровне мРНК обозначена сокращениями: ЗР – зонароста, ППК – первичные половые клетки, эктод – эктодерма, эктомезод –эктомезодерма, энтод – энтодерма, энтомезод – энтомезодерма, ? – данныеотсутствуют.
* собственные данные.Расположениегенетическоголокусатакжекрайневажновсвязиссуществованием дальнодействующих эпигенетических факторов, хорошо описанных,например, для Hox генов (Mallo, Alonso, 2013). Известно, что Hox-связанные гены Mox иEvx находятся у P. dumerilii на той же хромосоме, что и Hox кластер, хотя и не образуютс ним тандемной группы (Hui et al., 2012). Вероятно, такое расположение гомеобокс136содержащих генов Antennapedia класса сохранилось и у A.
virens, что может объяснитьраннюю мезодермальную экспрессию ряда этих генов наличием общего регуляторногоэлемента.Дляизученияконкретныхмеханизмовнеобходимыподходящиеэмбриологические модели и надежные методики трансгенеза, которые практическиотсутствуют для спиралий.Одним из наиболее разработанных модельных объектов среди Spiralia являетсянереида P. dumerilii (Fischer, Dorresteijn, 2004; Zantke et al., 2014).
Для этого видаполучены первые постоянные линии трансгенных и нокаутных животных (Backfisch etal., 2013; Backfisch et al., 2014). Трансгенез P. dumerilii проводился на основетранспозона Mos1, особенности работы которого были проанализированы в даннойработе. При этом была установлена необычная активность Mos1, выражающаяся ввариабельности границ вырезания и встраивания транспозона с возможностьюмножественной интеграции различных фрагментов в один геномный локус. Механизмработы Mos1 состоит во внесении двунитевого разрыва ДНК с образованием открытых5’ и 3’-концов, что теоретически может запускать NHEJ репарацию ДНК (Bannister et al.,2014).
Таким образом, полученные варианты ампликонов вектора после вырезаниятрансгена могли быть результатом внесенных репарацией инсерций и делеций. Тем неменее, сохранение в векторе-доноре частей терминальных повторов ITR требуетдополнительного объяснения, поскольку это противоречит каноническому способуформирования белкового комплекса транспозаз на петле ДНК и вырезаниютранспозона строго по концам ITR. Вероятно, имеют место различные промежуточныепродукты реакции, возникающие при неполном (однонитевом) разрыве ДНК не награнице ITR (Cuypers et al., 2012).Полученные данные помогают объяснить невысокую эффективность (<5%)трансгенеза P.
dumerilii с использованием Mos1 (Козин, 2013б; Backfisch et al., 2014). Вопервых, по ряду причин может нарушаться целостность трансгена, неспособного втаком случае обеспечить доставку желаемой последовательности. Во-вторых,множественная интеграция фрагментов трансгена может создать артефакты илиувеличить вероятность сайленсинга конструкции эндогенными системами защиты оттранспозонов. Известны и другие нежелательные особенности Mos1: для некоторыхорганизмов описаны предпочтительные места транспозиции, например у C. elegans –это гены, кодирующие рРНК (Granger et al., 2004), нарушение работы которых можетвызывать побочные эффекты. Все вышеизложенное побуждает к дальнейшему поиску137более совершенных систем для доставки трансгенных конструкций в геном P.
dumerilii.Перспективным в этом отношении выглядит трансгенез на основе интегразы phiC31(Knapp et al., 2015).Для прижизненного анализа экспрессии генов широкое применение нашелметод создания трансгенов на основе рекомбинантных бактериальных искусственныххромосом (BAC). Этот метод рутинно используется на классических объектах биологииразвития – дрозофиле, морском еже, мыши и др. (Lee et al., 2001; Narayanan, 2015).Преимуществом рекомбинантных BAC является полнота геномного контекста,обеспечивающего экспрессию репортера. Успешное применение этой методики на P.dumerilii было осуществлено нами впервые.
В данной работе была сконструированарекомбинантная BAC, содержащая репортер Avi-twist::eGFP-F2A-NTR. Для временноготрансгенеза, повторяющего экспрессию Twist в течение личиночного периода развития,достаточна инъекция в зародыши стандартно очищенного препарата ДНК (Maxiprep).Критическим этапом при этом является техника микроинъекций в зиготы P. dumerilii,которая обычно ведет к большому числу травмированных и аномально развивающихсязародышей.При сравнении геномных локусов Twist нереид A.
virens и P. dumerilii намудалось выявить в некодирующей гДНК ряд эволюционно-консервативных участков(ECR). Рекапитуляцию эндогенной экспрессии Twist с гДНК A. virens в клетках P. dumeriliiможно объяснить сохранением регуляторных элементов в пределах этих ECR (Kozin etal., 2014; Козин и др., 2015, 2016). Наши результаты подтверждают правильность иплодотворность выбора пары видов A.
virens–P. dumerilii для сравнительногогенетического анализа, способного вскрыть микро- и макроэволюционные изменениямеханизмов развития. Для более детального дальнейшего изучения строениярегуляторной области Twist необходимо провести трансгенез с использованиемотдельных ECR в качестве энхансеров и модифицировать имеющуюся рекомбинантнуюBAC, по-отдельности удаляя ECR. Сравнение полученных паттернов экспрессиирепортера позволит определить функцию конкретных цис-регуляторных элементов ипровести поиск связывающихся с ними ТФ для реконструкции вышележащихучастников генетической сети.С целью функционального анализа Twist у нереид для P. dumerilii быладаптирован метод TALEN-опосредованного мутагенеза (Backfisch et al., 2014; Козин идр., 2015).
Эффективность созданных TALEN twi-3L/R к Pdu-twist в тесте in vivo составила138не менее 17%, что превосходит результат многих других сконструированных для P.dumerilii пар TALEN (Bannister et al., 2014). Дизайн TALEN пары twi-3L/R отличаетсяотносительно длинными сайтами связывания (по 17 bp каждый) и протяженнымспейсером из 16 bp. Эти характеристики являются пригодными для P. dumerilii, чтонесколько расширяет диапазон рекомендуемых параметров.
Избранный автором путь– отбор высокоэффективных TALEN – потребовал более длительной и трудоемкойподготовки и проверки трех пар TALEN, вместо одной. Однако это позволило сократитьчисло инъецируемых зародышей и ускорило скрининг, обеспечив надежное получениежелаемого результата.
Такой подход можно рекомендовать и для дальнейших работ.Большее внимание следует уделять созданию пар TALEN, эффективных в тесте in vivo,что достигается конструированием нескольких TALEN к гену интереса и выборомнаилучшего варианта. Для инъекций успешно применяли как очищенные препаратымРНК TALEN, так и высокие концентрации неочищенной после реакции транскрипцииin vitro мРНК.
Последнее является удобным и предпочтительным способом подготовкимРНК для доставки в зиготы P. dumerilii.У инъецированных животных поколения G0 (мозаичных носителей мутации) и уих потомков-гетерозигот Pdu-twist+/- поколения G1 не было выявлено каких-либовидимых фенотипических отклонений от нормы. Тем не менее, подтверждениенаследования мутации делает возможным дальнейший генетический анализ с цельюполучения гомозиготы.
Животных следующих поколений различного генотипапредполагается специально проанализировать на предмет строения мышечнойсистемы и экспрессии мезодермальных маркеров, являющихся возможными генамимишенями Pdu-twist.4.2. Ранняя экспрессия Twist в мезодермальных бластомерахМеханизмы спецификации клеточных линий в раннем эмбриональном развитииявляются одним из наиболее важных вопросов современной эмбриологии. ДлязародышейSpiraliaпредопределенностьоченьхарактернасудьбыбластомеровдетерминативность,уженастадияхт.е.жесткаядробления.Пригетероквадрантном спиральном дроблении, как у нереид, с морфологической точкизрения соответствие осей тела конкретным квадрантам можно проследить уже начетырехклеточной стадии. Сегрегация одной из самых ранних клеточных линий –первичных трохобластов – завершается во время пятого клеточного цикла.
Основным139гипотетическиммеханизмомэтихсобытийпринятораспределение компонентов цитоплазмы яйцасчитатьнеравномерное(ооплазматическую сегрегациюдетерминантов развития).Для моллюсков описан интереснейший способ наследования специфическихмРНК в череде клеточных делений (Lambert, Nagy, 2002; Kingsley et al., 2007; Perry et al.,2015).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
