Диссертация (1145742), страница 25
Текст из файла (страница 25)
dumerilii из инбредных линий PIN, VIO, FL2.Ампликоны содержат первый экзон и интрон Pdu-twist, составляя во всех образцах ~7kb, что соответствует длине последовательности из геномной базы данных. М –дорожка с маркером молекулярного веса 2-Log (NEB).Рис. 49. Аннотированная последовательность первого экзона Pdu-twist. Фиолетовымвыделены участки, кодирующие консервативные домены bHLH и WR, зеленым –позиции праймеров #2328 и #2432, коричневым, оранжевым и красным – участки,123связывающие TALEN, циановым – сайты рестрикции в спейсерах TALEN, серыетреугольники – позиции SNP.
Цифрами обозначена длина последовательности в bp.Сравнение установленных последовательностей первого экзона Pdu-twistвыявило девять сайтов однонуклеотидного полиморфизма (SNP) (Рис. 49). Эти SNPприходились на третий нуклеотид в триплете и не изменяли аминокислотнуюпоследовательность у разных аллелей. Преобладающий вариант (пять идентичныхпоследовательностей) был назван аллелью А, альтернативный вариант – аллелью В.Дизайн трех пар TALEN был подобран так, чтобы избежать перекрывания с сайтамиполиморфизма (Рис. 49), поскольку для эффективного связывания белков TALEN с ДНКнеобходимоабсолютноесоответствиенуклеотиднойпоследовательностисраспознающими ее специфическими доменами. Для связывания TALEN были выбранысайты перед последовательностью, кодирующей bHLH домен Pdu-twist, так что эффектот действия TALEN (двунитевой разрыв ДНК с последующей репарацией NHEJ ивозможным сдвигом рамки считывания) нарушил бы этот функциональный домен.Было сконструировано три пары TALEN (twi-1L/R, -2L/R, -3L/R), связывающихсайты ДНК от 13 до 17 bp с длиной спейсера от 12 до 16 bp.
КлонированныепоследовательностиTALENбылипросеквенированыдляподтвержденияихкорректности. Полученную методом транскрипции in vitro мРНК каждой пары TALENинъецировали в зиготы P. dumerilii, после чего личинок (24 чпо) использовали дляскринингамутаций спомощьюПЦР ипоследующей рестрикции.Самымиэффективными мутагенами оказалась пара TALEN twi-3L/R, обладающая наиболеедлинными сайтами связывания (по 17 bp каждый) и наибольшим спейсером (16 bp). Порезультатам ПЦР и рестрикции (Рис.
50) в 39 пробах было выявлено 20 проб сдополнительными более короткими (в 11 пробах) и/или с непереваренными (в 17пробах) фрагментами первого экзона Pdu-twist, несущих мутации. В расчете на одногоинъецированного зародыша (в каждой пробе находилась ДНК от трех объектов)вероятность получения мутации с помощью пары TALEN twi-3L/R составляет от 17% до51%.124Рис.
50. Проверка активности TALEN twi-3L/R с помощью ПЦР на гДНК инъецированныхзародышей. Дорожки а – ампликоны первого экзона Pdu-twist до рестрикции (у дикоготипа – 483 bp), б – ампликоны после рестрикции с BamHI (у дикого типа – 315 bp + 168bp), контроль – образцы из неинъецированных зародышей, М – маркер молекулярноговеса 2-Log (NEB), цифрами справа обозначена длина фрагментов ДНК в bp.Дополнительные более короткие ампликоны (с делецией) отмечены белойзвездочкой, непереваренные полоски (с мутацией сайта BamHI) – двумя чернымизвездочками.Клонирование и секвенирование десяти мутантных ампликонов показалоналичие в них различных indel-мутаций (инсерций и делеций) (Рис. 51).
Делецииохватывали фрагменты длиной 1–286 bp и во всех случаях приводили к сдвигу рамкисчитывания, т.е. к нокауту функционального гена. В трех случаях на фланкирующихделецию участках встречались нуклеотиды (от одного до шести), отличающиеся отпоследовательности дикого типа. Таким образом, можно говорить об успешностиработы белков TALEN twi-3L/R, которые индуцируют двунитевой разрыв гДНК вкодирующей последовательности Pdu-twist. По-видимому, это активирует у P. dumeriliiтипичное для эукариот негомологичное воссоединение концов ДНК (репарацию NHEJ),что сопровождается внесением делеций и случайных нуклеотидов на месте разрыва(Wyman, Kanaar, 2006).125Рис. 51. Выравнивание ампликонов первого экзона Pdu-twist, полученных после ПЦРскрининга TALEN-индуцированных мутаций.
Положение TALEN twi-3L/R показанокрасными блоками сверху на последовательности дикого типа (WT), рестрикционныйсайт BamHI в спейсере – циановым. Несовпадающие с диким типом позициивыделены зеленым, отсутствующие нуклеотиды – знаком -, обозначение мутацийприведено слева: за префиксом Δ- указана длина делеции в bp, перед аббревиатуройSNV (single nucleotide variant) приведено количество нуклеотидных замен.Из дополнительных инъецированных зародышей P. dumerilii были полученыполовозрелые особи.
В связи с высокой вероятностью получения больших (>100 bp)делеций, видимых при электрофорезе, генотипирование велось c помощью ПЦР безпоследующей реакции рестрикции. Отбор на большие делеции позволил сократитьвремя скрининга и значительно упростить всю процедуру. При проверке на мутациюследующего поколения (G1 – потомство инъецированных особей) в четырех из девятипрогенотипированных партий помимо ампликонов дикого типа были обнаруженыдополнительные более короткие фрагменты.
Ювенильные животные из этих партий(содержащих гетерозиготы Pdu-twist+/-) не проявляют фенотипических отклонений отнормы. Скрещивание гетерозигот позволит вывести данную мутацию в гомозиготноесостояние и выяснить функцию гена Pdu-twist.1263.3. Активность MAP-киназного сигналинга в эмбриогенезе3.3.1. Выявление компонентов каскада MAP-киназВ геномной и транскриптомной базе данных у P. dumerilii было найдено поодному гену-ортологу MAPKK (Mek) и MAPK1/2 (Erk1/2) – ключевых терминальныхэлементов MAP-киназного сигнального пути. Временной паттерн экспрессии Pdu-mapkkи Pdu-mapk1/2 на уровне мРНК был исследован с помощью полуколичественнойполимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR).Рис.
52. Результаты RT-ПЦР, отражающие временную динамику уровня экспрессии Pdumapkk и Pdu-mapk1/2. Цифрами на оси абсцисс обозначены стадии развития: 1 –выметанные неоплодотворенные яйца (0 чпо); 2 – начало формирования второгоквартета микромеров (3,5 чпо), 3 – формирование соматобласта 4d и четвертогоквартета микромеров (5 чпо), 4 – переход к билатеральному дроблению иформирование М-клеток (5,5 чпо), 5 – поздняя гаструла/протрохофора (16 чпо), 6 –ранняя трохофора (24 чпо), 7 – ранняя метатрохофора (48 чпо), 8, 9 – нектохета (72 чпои 96 чпо).
А – ампликоны Pdu-mapkk, Pdu-mapk1/2 и референсного гена Pdu-rps9 наагарозном геле. Б – график с рассчитанным относительным уровнем мРНК Pdu-mapkk(синий) и Pdu-mapk1/2 (красный).127Транскрипты обоих генов присутствуют на всех проанализированных стадияхразвития, начиная с неоплодотворенного яйца и заканчивая средней нектохетой (96чпо) (Рис. 52). С момента нереста и до конца дробления уровень экспрессии Pdu-mapkkи Pdu-mapk1/2 остается практически неизменным.
На более продвинутых стадиях(поздняя гаструла/протрохофора (16 чпо), ранняя трохофора (24 чпо), ранняяметатрохофора (48 чпо) и ранняя нектохета (72 чпо)) можно наблюдать некотороеснижение относительного количества транскриптов Pdu-mapkk. В случае Pdu-mapk1/2колебания уровня экспрессии на личиночных стадиях были менее существенны (Рис.52).Присутствие мРНК гомологов MAPKK и MAPK1/2 в течение эмбриональногоразвития P.
dumerilii позволило предположить, что MAPK-сигналинг, как и при развитииряда моллюсков, может быть задействован в спецификации мезодермы у нереид.Поскольку этот вопрос не получил однозначного решения в исследовании на P.dumerilii (Pfeifer et al., 2014), была предпринята попытка изучить активность MAPкиназы в раннем эмбриональном развитии A. virens.Активация MAP-киназы, выявленная с помощью антител к фосфорилированнойформе Erk1/2 (dpErk1/2), наблюдалась у A. virens со стадии восьми бластомеров.
В этотмомент все клетки зародыша претерпевали митоз, находясь в анафазе (Рис. 53 А–А’’).Активная форма Erk1/2 колокализовалась с хромосомным материалом трех клеток:микромеров 1c, 1d и макромера 1D (Рис. 53 А, Таблица 2). Эти три клетки расположенына дорсальной стороне зародыша так, что тесно контактируют друг с другом. Наследующей проанализированной стадии 16-ти бластомеров (интерфаза пятогоклеточного цикла) все 12 микромеров (т.е. 1q1, 1q2 и 2q), независимо отпринадлежности к одному из четырех квадрантов, демонстрировали ядерную окраскуна dpErk1/2 (Рис. 53 Б, Таблица 2). Напротив, во всех четырех макромерах (2A, 2B, 2C и2D) отсутствовал сигнал dpErk1/2 (Рис. 53 Б–Б’’, Таблица 2).128Рис.
53. Распределение активной формы МАР-киназы в ходе дробления у A. virens.Иммуноцитохимическое выявление dpErk1/2 (зеленый канал), тубулина (красный) иокраска DAPI на ДНК (синий), максимальная проекция конфокального Z-стека. Д–Д ’’ –вид с вегетативного полюса, дорсальная сторона справа; остальные – вид санимального полюса, дорсальная сторона внизу. В каждом вертикальном столбце (A–A’’, Б–Б’’, B–B’’, Г–Г’’, Д–Д’’) представлен один и тот же зародыш, стадия развитияуказана сверху.
Разные каналы показаны в вертикальных рядах: А–Д – антитела кdpErk1/2 (вместе с антителами к тубулину в Д–Д’’); А’–Д’ – DAPI; А’’–Д’’ – совмещениевсех каналов. Бластомеры с сигналом dpErk1/2 подписаны на А–Д;идентифицированные клетки, не проявляющие иммунореактивность к dpErk1/2,подчеркнуты на Д, А’–Г’. Стрелка указывает на полярные тельца (анимальный полюс).Масштаб 50 мкм.После деления макромера 2D на клетки 3d и 3D наступает стадия 17-тибластомеров.
У таких зародышей утрачивается наблюдавшаяся ранее радиальнаясимметрия распределения dpErk1/2. В новообразованных клетках третьей генерации3d и 3D наблюдается активация MAPK-сигналинга, тогда как во всех делящихсямикромерах (а именно 1a1, 1c1, 1d1 и 2d) он выключается (Рис. 53 В–В’’, Таблица 2). Всравнении с другими микромерами первого квартета 1q1 бластомер 1b1 несколькоотстает в продвижении по клеточному циклу, что сопровождается сохранением в егоядре активности Erk1/2. Кроме того, dpErk1/2 продолжает маркировать интерфазныеядра микромеров первого квартета 1q2 и второго квартета (2a, 2b, 2c) (Рис.
53 В–В’’,Таблица 2). Макромеры 2A, 2B и 2C у изученных объектов находятся в метафазе илишены сигнала dpErk1/2 в данный момент.129Таблица 2. Распределение dpErk1/2 в клеточных линиях зародышей A. virensквадрант8 бластомеров,4-й клеточныйцикл16 бластомеров,5-й клеточныйцикл1a117 бластомеров,5–6-й клеточныйцикл1a1111a (met)1a (an)A23 бластомера,5–6-й клеточныйцикл1a121a21a21a2 (met)2a2a2a2A2A (met)2A (an)1A (an)1b11b11b (an)B1b111b121b21b21b2 (met)2b2b2b2B2B (met)2B (an)1B (an)111c111c1c (an)1c21c21c2 (met)2c2c2c2C2C (met)1c (an)1c12C1C (an)3c3C1d111d (an)1d (an)1d21d21d111d121d2 (an)2d1D2d2d (met)2d21D (an)3d3d3D3D2DЯдра dpErk1/2-положительных бластомеров обозначены обычным шрифтом;бластомеры с отсутствием ядерного сигнала dpErk1/2 подчеркнуты.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
