Диссертация (1145742), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Как было показано ранее (Backfisch et al., 2013; Backfisch et al., 2014), в116геноме этих животных содержится не менее одной копии трансгена, обеспечивающегоэкспрессию флуоресцентного белка GFP с промотора гена α-тубулина или r-опсина P.dumerilii. Для выяснения границ встроившегося транспозона на матрице гДНКтрансгенных животных проводили TAIL (thermal asymmetric interlaced) ПЦР (TAIL-PCR).Полученныеампликоныклонировалиисеквенировали.Установленныепоследовательности выравнивали с последовательностью вектора-донора (Рис. 42).Рис. 42. Выравнивание ампликонов гДНК из TAIL-ПЦР и вектора-донораpMos{rps9::egfp}frkt1074.
Цифрами обозначена длина последовательности в bp.Праймеры для TAIL-ПЦР показаны зелеными треугольниками, векторная область запределами трансгена – зелеными блоками, часть ампликона, соответствующаяпоследовательности в векторе – зеленой линией.В случае трансгенной линии tuba::egfpvbci1 можно говорить о существовании какминимум двух сайтов интеграции, поскольку были получены ампликоны, несводимыек единой модели. В одном ампликоне трансген заканчивался за 67 bp до конца 3’ ITR,после чего следовала предполагаемая гДНК.
В другом варианте ампликоновпоследовательность встроенного трансгена содержала векторную область, которая неменее чем на 183 bp выдавалась за границу 3’ ITR (Рис. 42). Для линии r-opsin::egfpvbci2были получены ампликоны, реконструируемые в один вариант сайта интеграции. Вэтом варианте векторная часть трансгена на расстоянии 496 bp от границы 3’ ITRпереходит в последовательность обширного фрагмента CDS флуоресцентного белкаdsRed.
Следует отметить, что идентичная последовательность dsRed является частьютрансгенной конструкции, расположенной внутри транспозона (Рис. 40 А). Появлениевторой копии dsRed на границе встроившегося транспозона может быть объясненосуществованием неканонического способа интеграции с включением более одногоучастка экзогенной ДНК в геномный локус хозяина.117Таким образом, важными особенностями работы транспозазы Mos1 в клетках P.dumerilii являются вариабельность границ вырезания и встраивания транспозона, атакже возможность множественной интеграции различных фрагментов в одингеномный локус. Эти свойства, по-видимому, и являются причиной малойэффективности (<5%) трансгенеза с использованием Mos1 (Backfisch et al., 2014).3.2.2. Трансгенез на основе рекомбинантной BACГенетические конструкции на основе рекомбинантной BAC (бактериальнаяискусственнаяхромосома,bacterialartificialchromosome)являютсяхорошоразработанной системой для трансгенеза.
ВАС-клоны, из которых состоят геномныебиблиотеки, могут вмещать обширные фрагменты гДНК (до 150–300 kb каждый). Такиефрагменты содержат полноразмерные локусы генов, включая далеко отстоящие откодирующей ДНК регуляторные области (энхансеры и сайленсеры). Для созданиярепортерного трансгена на основе BAC в CDS гена интереса внедряют, например,нуклеотидную последовательность GFP. После доставки в организм хозяинарекомбинантная ВАС обеспечивает тканеспецифичную экспрессию флуоресцентногомаркера.Стратегия нашего исследования состояла в том, чтобы создать на основе ВАСклона из геномной библиотеки A. virens репортерный трансген и проверить его работув клетках близкородственного вида – P. dumerilii. Известно, что геном у A.
virens почтивдвое меньше, чем у P. dumerilii (Zantke et al., 2014). A. virens также обладает болеекомпактными генетическими локусами, в которых потенциальные регуляторныеучастки ближе расположены к CDS, чем у P. dumerilii (Ф. Райбле, личное сообщение).Кроме того, степень дивергенции некодирующей гДНК у этих двух видов подходит длявыявления эволюционно-консервативных регуляторных участков (т.н. phylogeneticfootprinting) (Zantke et al., 2014). Репортеры на основе рекомбинантной ВАС A. virens небылиранееиспользованыдлятрансгенезаP.dumerilii,хотяявляютсямногообещающими более компактными конструкциями, в особенности учитываяпроблему нестабильной работы транспозаз у P.
dumerilii.В геномной ВАС-библиотека A. virens с помощью Саузерн-гибридизации былоидентифицировано 9 клонов, содержащих фрагмент гена Avi-twist. После сравненияэтих клонов рестрикционным анализом (Рис. 43) один из них (69М19) былпросеквенирован. Полученные последовательности удалось собрать in silico в 17118контигов с общей длиной вставки (без векторной области) 140,6 kb. Контиг,содержащий локус Avi-twist составил 23,6 kb, из которых 11,4 kb находились “выше”(up-stream) 5’-конца известной кДНК.Рис. 43. Анализ ВАС-клонов, содержащих локус гена Avi-twist. А – рестрикция 8 клонов сEcoRI, HindIII и EcoRI+HindIII (подписано сверху).
Б – саузерн-гибридизация с зондом изфрагмента кДНК Avi-twist. Цифрами подписаны порядковые номера анализированныхклонов, М – дорожка с маркером молекулярного веса 2-Log (NEB), шкала слева – длинав см. Звездочкой отмечены фрагменты, содержащие последовательность Avi-twist усеквенированного клона № 3 (координаты в ВАС-библиотеке 69M19): 4,6 kb + 3,2 kb(EcoRI), 11,8 kb (HindIII), что соответствует положению сайтов рестрикции в полученныхконтигах.Выравнивание геномных локусов Twist A. virens и P.
dumerilii по алгоритмуMULAN позволило выявить в этой 5’-области контига 6 эволюционно-консервативныхучастков (ECR). 8 ECR находилось внутри интрона, а еще 2 ECR – “ниже” (down-stream)3’-конца кДНК (Рис. 44). Сохранение у двух видов нереид этих ECR в некодирующейгДНК говорит в пользу их возможной функциональной значимости как регуляторныхмодулей. Вместе с тем, сравнение локусов Twist нереид и других беспозвоночных спросеквенированным геномом (полихета Capitella teleta, моллюск Crassostrea gigas,ланцетник Branchiostoma floridae) не позволило обнаружить ECR в некодирующейгДНК, что говорит о сильной дивергенции регуляторных областей этого гена дажесреди Spiralia.119Рис. 44. Выравнивание геномных локусов Twist A.
virens и P. dumerilii по алгоритмуMULAN. На последовательности локуса гена Avi-twist аннотированы кодирующая частьв первом экзоне (синий блок), 5’ UTR (желтый блок) и эволюционно-консервативныеучастки ECR (коричневые блоки). На графике снизу отражен уровень идентичности (впроцентах от 50 до 100%) нуклеотидных последовательностей A. virens и P. dumerilii напротяжении 100 bp. Цифрами внизу обозначена длина последовательности в kb.По протоколу BAC-рекомбинации (Ejsmont et al., 2009) в CDS Avi-twist былавнедрена кодирующая последовательность eGFP (enhanced GFP) и отделеннаямотивом F2A последовательность нитроредуктазы. В векторную область BAC тем жепутемвстраиваликассетустерминальнымиинвертированнымиповторамитранспозона Tol2.
Успешность и правильность внедрения кассет проверяласьрестрикционным анализом (Рис. 45) и секвенированием амплифицированных в ПЦРсайтов интеграции.Рис. 45. Рестрикционный анализ (XhoI) ВАС-клона 69M19 , содержащего локус гена Avitwist, на разных этапах рекомбинации. 1 – клон дикого типа, 2 – после первого актарекомбинации, 3 – после второго акта рекомбинации, М – дорожка с маркероммолекулярного веса 2-Log (NEB). Звездочками отмечены фрагменты с измененной120длиной, что соответствует ожидаемому положению сайтов рестрикции послерекомбинации.Препараты ДНК, выделенные из рекомбинантных ВАС, инъецировали в зиготы P.dumerilii.
Работа репортерной конструкции Avi-twist::eGFP-F2A-NTR была проверена спомощью конфокальной микроскопии на стадии поздней трохофоры (40 чпо).Оказалось, что eGFP дифференциально экспрессируется в мезодермальных зачатках. Вмезодермальных полосках отдельные группы eGFP-положительных клеток былиметамерно организованы в виде поперечных полос в основании хетоносных мешков(Рис.
46). Наиболее интенсивным сигнал eGFP был в эктомезодермальных клетках,расположенных выше и по бокам от стомодеума (Рис. 46). Этот паттерн экспрессиитрансгена соответствует картине распределения мРНК Twist у P. dumerilii и A. virens, всвязи с чем можно констатировать успешность выбранного подхода.
Из экспериментаследует, что гДНК использованного ВАС-клона A. virens содержит регуляторныеобласти, достаточные для запуска тканеспецифичной экспрессии Twist. Кроме того, этирегуляторные элементы консервативны в пределах нереид, так что могут работать ублизкородственных видов, таких как P. dumerilii и A. virens.Рис. 46. Экспрессия трансгена Avi-twist::eGFP-F2A-NTR у средних трохофор P.
dumerilii(36 чпо). Прижизненные наблюдения, максимальная проекция конфокального Z-стека,каналы подписаны в верхнем правом углу: eGFP (зеленый), TRITC (красный), DIC(серый). А, Б – анимальная проекция, дорсальная сторона (dors) сверху; А–З –вентральная проекция одного и того же объекта, В, Г и Д–З – 2 разные фокальныеплоскости. Экспрессия еGFP в энтомезодермальных клетка показана белымистрелками, экспрессия в эктомезодерме – оранжевыми треугольниками, Х –вегетативный полюс (область проктодеума), звездочка – область стомодеума.Масштаб 50 мкм.121Наиболее раннюю экспрессию трансгена Avi-twist::eGFP-F2A-NTR удалосьвыявить на начальных этапах гаструляции P.
dumerilii (9 чпо). В отличие от результатовгибридизации in situ, по которым мРНК Twist присутствует в соматобласте 4d, егодочернихклеткахМиэктомезодермальныхбластомерах3a–3d,eGFPнеобнаруживается в М-клетках, однако его экспрессия происходит в нескольких крупныхбластомерах, предположительно эктомезодермальной природы (Рис. 47). Болеедетального описания ранней работы трансгена получить не удалось, что связано смалойэффективностьюиспользованногопротоколамикроинъекцийвысокомолекулярных препаратов ВАС ДНК, приводящего к высокой смертности ибольшому количеству аномалий развития.Рис.
47. Экспрессия трансгена Avi-twist::eGFP-F2A-NTR у ранней гаструлы P. dumerilii (9чпо). Прижизненные наблюдения, максимальная проекция конфокального Z-стека,каналы подписаны в верхнем правом углу: eGFP (зеленый), TRITC (красный), DIC(серый). Масштаб 50 мкм.3.2.3. Мутагенез с помощью нуклеаз TALENДля получения нокаутных P. dumerilii был избран наиболее современный иэффективный метод на основе нуклеаз TALEN (Transcriptional Activator-Like EffectorNuclease) (Christian et al., 2010), в качестве гена-мишени – Pdu-twist.
Анализ структурыэтого гена приведен в разделе 3.1.1. Для подбора дизайна TALEN требовалось преждевсего установить сайты полиморфизма в кодирующей части гена. Для этого у девятиживотных из трех инбредных линий (PIN, VIO, FL2) из гДНК была амплифицирована122последовательность первого экзона Pdu-twist и последовательность, включающая обаэкзона и интрон.
Ампликоны, содержащие интрон не отличались по длине, котораясоставляла около 7 kb (Рис. 48), что соответствовало данным геномной базы. Поразличиям в длине интрона можно выявить разные аллели гена, однако в случае Pdutwist такого выраженного полиморфизма не наблюдалось. Амплифицированныепоследовательности первого экзона Pdu-twist также имели одинаковый размер (0,7kb), поэтому шесть из них были клонированы и просеквенированы.Рис. 48. Результаты ПЦР на гДНК P.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
