Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1145717), страница 8

Файл №1145717 Диссертация (Пути стабилизации и дестабилизации генома клеток костного мозга мыши при действии ольфакторных хемосигналов) 8 страницаДиссертация (1145717) страница 82019-06-29СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 8)

В результате повреждений теломеры становятся ломкими сайтами имогут вызывать склейки хромосом между собой (Dimitrova et al., 2006; Denchi, de Lange,2007). В норме теломеры стабилизируются шелтеринами, защищающими их отраспознавания белками ответа на повреждения ДНК (DDR – DNA damage response) (deLange, 2009). Нарушения функционирования субъединиц шелтеринов приводит костановке вилки репликации, активации ATR (Denchi, de Lange, 2007), ATM испособствует накоплению маркеров двунитевых разрывов - γ-H2AX, 53BP1 и MRN (Takaiet al., 2003).Методы выявления геномной нестабильностиСуществуют различные методики выявления повреждений ДНК, результата ихошибочной репарации, а также – нарушений, которые могут приводить к дестабилизациигенома (например, замедление или остановка вилки репликации) (рис.

2).Замедление вилки репликации может быть выявлено при включении меченыхоснований в клетки, находящиеся на стадии S фазы клеточного цикла (Dominguez-Sanchezet al., 2011; Flach et al., 2014). Замедление репликации идентифицируется по сокращениюучастков новосинтезированной ДНК с включенными мечеными основаниями, посравнению с мечеными участками клеток, нормально реплицирующих ДНК (рис. 2, «Б»)При применении метода импульсного 2D-электрофореза с последующим Саузернанализом может быть выявлена полная остановка вилки репликации (рис.

2, «А») (Prado,Aguilera, 2005b).29Рис. 2. Геномная нестабильность и некоторые методы её выявления (модиф. по Aguilera,Garcia-Muse, 2013). (А) Метод 2D-электрофореза, совмещенный с Саузерн-анализомвыявляет остановку вилки репликации. (Б) Анализ включения двух аналогов тимидина(IdU и CldU) используют для выявления замедления вилки репликации. (В) ВыявлениеДНР по увеличению количества фокусов гистонов γ-H2AX или клеток с повышеннымтотальным уровнем гистона γ-H2AX.

(Г) Визуализация повреждений ДНК методомкометного электрофореза (в нейтральной среде кометный электрофорез выявляет ДЦР, а вщелочной – одноцепочечные разрывы и щелочелабильные сайты). (Д) Цитогенетическийметод выявления сестринских хроматидных обменов. (Е) Цитогенетический метод30выявлениямикроядер.(Ж)Метафазный(цитогенетический)методвыявленияхромосомных аберраций. (З) Цитогенетический метод выявления аномалий головокспермиев. (И) Выявление слипания теломер методом CO-FISH. (К) Выявление сайтовломкости хромосом при окраске по Гимза.

(Л) Анафазные мосты, выявляемые анателофазным методом учета хромосомных аберраций.На картинках стрелки указывают на выявляемые типы генетических нарушений. Там гдевозможно, контрольные образцы приведены на верхних (для «А» и «З» – на верхнихлевых) иллюстрациях.Нарушения репликации, как и генотоксические воздействия, могут приводить квозникновению повреждений ДНК.

Для выявления двунитевых разрывов применяютметод окрашивания фосфорилированных гистонов γ-H2AX (рис. 2, «В»), а также методнейтрального кометного электрофореза (рис. 2, «Г»). Например, уже через несколькоминут после рентгеновского облучения в костном мозге мышей обнаруживаетсязначительное повышение количества клеток с фокусами гистона γ-H2AX, а пикфосфорилирования приходится на 1 час после облучения (Paris et al., 2011). При этом внекоторых случаях (например, при старении) фосфорилированные гистоны γ-H2AX невсегдамаркируютдвунитевыеразрывы,поэтомурекомендуетсяпроводитьдополнительное тестирование на выявление ко-активации одного из белков репарации,например ATM или 53BP1 (Flach et al., 2014).Щелочной кометный электрофорез позволяет выявить, помимо двунитевых, ещё иодноцепочечные разрывы, а также – апуриновые и апиримидиновые сайты, которые такженазываются щелочелабильными.

При предварительном лизирующем воздействии наобразцы все эти повреждения ДНК переходят в состояние двунитевых разрывов ивизуализируются как «хвост кометы» при последующем электрофорезе (Дурнев и др.,2006).Ещё одним методом, выявляющим повреждения ДНК, является идентификацияломких сайтов хромосом (рис. 2, «К»). Некоторые сайты ломкости являютсянаследуемыми, при этом часть ломких сайтов может возникать при репликативномстрессе из-за остановок вилки репликации (Letessier et al., 2011).Ряд методов позволяет выявить структурные геномные нарушения, возникающие врезультатеошибочнойхроматидные обменырепарацииповрежденийДНК.Например,сестринские(рис.

2, «Д») возникают в ответ на разрывы ДНК и являютсяследствием их репарации (Wechsler et al., 2011).31Для различных тканей существуют специализированные методики выявлениягеномных нарушений. Для клеток костного мозга используют тест по выявлениюмикроядер – бесцентромерных фрагментов хромосом, не попавших в клеточное ядро вмомент деления клеток (рис. 2, «Е») (Fenech et al., 2011). Для спермиев используют тестпо выявлению аномальных головок (рис. 2, «З»), наличие которых говорит опроизошедших в клетке геномных нарушениях (Gotoh, 2010). Ещё один метод выявлениягеномной нестабильности связан с оценкой длины теломер в делящихся клетках. Присокращении длины теломер появляется вероятность их слипания (рис. 2, «И»), которое, всвою очередь, ведет к появлению цитогенетических нарушений в процессе деления клетки(Martinez et al., 2009).Одним из наиболее часто применяемых методов выявления дестабилизации геномаявляется анализ хромосомных аберраций.

Метафазный метод анализа хромосомныхаберраций (рис. 2, «Ж») позволяет выявлять изменение числа хромосом, наличие крупныхделеций и дупликаций. В случае использования многоцветного флуоресцентногоокрашивания можно также сточностью выявить реципрокные и нереципрокныетранслокации (Liyanage et al., 1996). Ана-телофазный метод анализа хромосомныхаберраций (или нарушений митоза) позволяет выявить цитогенетические нарушения приделении клетки: хромосомные мосты, фрагменты, а также отставшие хромосомы (рис. 2,«Л»).

При этом наиболее частыми причинами возникновения анафазных мостов могутявляться нереципрокные транслокации (дицентрические хромосомы), слипание теломер,нерасхождение сестринских хроматид, а также незавершенная репликация (Aguilera,Garcia-Muse, 2013).1.2.2 Механизмы дестабилизации генома при стрессеНа сегодняшний день проведен целый ряд исследований, демонстрирующихсуществование различных механизмов, через которые стресс может приводить кдестабилизации генома клеток.Наклеточнойлиниимышиных3Т3фибробластовбылопоказано,чтокортикостерон, адреналин и норадреналин приводят к возникновению микроповрежденийДНК, выявляемых методом щелочного кометного электрофореза, при 10- и 30-минутномвоздействии гормонами (Flint et al., 2007, 2013).

При этом эффект от действиякортикостерона пропадал при блокировании глюкокортикоидных рецепторов (блокатор –RU486), а эффект катехоламинов исчезал при действии блокатора β2-адренорецепторов –пропранолола. Кроме того, одновременное действие адреналина, норадреналина и32кортикостерона приводило к более сильному эффекту, по сравнению с воздействиемлюбого из стресс-гормонов в отдельности.

Важно отметить, что при обработке клетоксывороткой крови мышей, стрессированных двухчасовой иммобилизацией, наблюдалиувеличение поврежденности ДНК, по сравнению с воздействием сыворотки интактныхмышей (Flint et al., 2007).Данные, полученные на клеточных линиях, подтверждаются экспериментами, вкоторых мышам вкалывали стресс-гормоны, тем самым моделируя физиологическийстресс. Так, ежедневные инъекции синтетического аналога адреналина – изопротеронола –в течение 30-ти дней приводили к формированию двунитевых разрывов ДНК(фосфорилированию гистонов γ-H2AX) и формированию хромосомных перестроек втимусе и семенниках мышей (Hara et al., 2011). В данной работе был детально изученвнутриклеточный механизм, обуславливающий этот эффект (рис.3, «А»).Рис.

3. Молекулярные механизмы повреждения ДНК (А) в клетках тимуса и семенниковпримногократных инъекциях изопротеранола (по Hara et al., 2011), (Б) вгематопоэтических стволовых клетках (ГСК) при однократной инъекции полиинозиновойполицитидиловой кислоты (Пл-Пц) (по Walter et al., 2015).Связывание изопротеранола с β2-адренорецепторами запускает сразу два сигнальныхпути, каждый из которых приводит к повреждениям ДНК.

Первый путь связан сактивацией протеинкиназы А за счет Gs-субъединицы адренорецептора (Gs/PKA), чтоприводит к усилению синтеза свободных радикалов, которые, проникая в ядро,повреждают ДНК. Второй сигнальный путь связан с активацией цитоплазматического33белка β-аррестина-1 (ARRB1), который, активируя киназный путь PI3K/AKT, приводит кфосфорилированию белка MDM2 в ядре клетки. Фосфорилированный MDM2 (фосфоMDM2) вместе с ядерной изоформой β-аррестина-1 убиквитинилируют белок p53, выводяего из ядра для последующей деградации.

Этот процесс снижает защитный потенциалрепарационных систем, сам по себе приводя к увеличению количества повреждений ДНК.Таким образом, активация β2-адренорецепторов при хроническом стрессе приводит, содной стороны, к ослаблению репаративных систем ядра, а с другой – к накоплениюсвободных радикалов, результатом чего является двукратное увеличение количествафосфорилированных гистонов γ-H2AX (Hara et al., 2011). Эти данные были повторены invitro на эмбриональных плюрипотентных клетках, причем с использованием методакометного электрофореза было показано, что уровень повреждений от воздействия 10мкМоль изопротеранола сопоставим с эффектом от 100 мкМоль перекиси водорода (Sun etal., 2015).То, что белок p53 уходит из ядра при стрессе, было показано и в другомисследовании, где мышей в течение недели подвергали ежедневной шестичасовойиммобилизации (Feng et al., 2012).

Характеристики

Список файлов диссертации

Свежие статьи
Популярно сейчас
Зачем заказывать выполнение своего задания, если оно уже было выполнено много много раз? Его можно просто купить или даже скачать бесплатно на СтудИзбе. Найдите нужный учебный материал у нас!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6392
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее