Диссертация (1145490), страница 44
Текст из файла (страница 44)
Коэффициент корреляции линейной зависимостимежду откликом массива и логарифмом концентрации МС в процессе ПППвалидации приближался к единичному значению и составил R2 = 0.742, Рис.VIII.5.Среднеквадратичное отклонение прогнозирования, СКОП, составило 0.49 единицв логарифмической шкале концентрации МС. Предел чувствительности МС науровне 0.014 мкг/л был оценен с применением метода 3σ (ПЧ = 3σ/S, где σ – этосреднеквадратичная ошибка калибровки СКОК, рассчитанная в мкг/л, а Sугловой коэффициент регрессионной кривой на этапе калибровки, он составлял0.803). Такой результат является перспективным, учитывая сложность222аналитической задачи и нижний предел обнаружения МС, меньше, чемустановленное значение ПДК в 1 мкг/л.-log[МС], массив сенсоровКалибровкаПерекрестная проверкаR 2кал =0.803R 2ППП=0.742-log[МС], метод ЖХРис.VIII.5 График «введено-найдено» ПЛС1-модели для определения содержанияMC-LR в водопроводной воде с помощью массива потенциометрических сенсоровпротив референтного ЖХ метода [364].
См. Приложение 1 для исходных данных.Хемометрическая коррекция дрейфа отклика сенсоров во времени былапроведенапосредствомразбиениямассиваданных,измеренныхпотенциометрической мультисенсорной системой в течение всего периода ростацианобактерий на два подмассива, соответствующих двум различным фазам ихроста: образцов с низким содержанием МС (1.9-8.3 мкг/л), собранных в течениепервого месяца роста, а также образцов с существенным содержанием МС (28 300 мкг/л).
Принимая во внимание последовательные разведения фильтратовштамма M. aeruginosa в питьевой воде (в соотношениях 1:3333, 1:1666, 1:1000,1:500, 1:100, 1:20), в набор данных с низким и высоким содержанием МС входили45 и 60 образцов соответственно. В каждом наборе в качестве тестового наборадля ПЛС моделирования была произвольно выбрана одна треть образцов (15 или20 образцов), оставшиеся образцы использовали для калибровки. Процедуруслучайного разбиения (СР) повторяли 20 раз для наборов данных с низким и223высоким содержанием МС. Чтобы оценить полученные ПЛС модели, значенияСКОК были усреднены для каждого их двух подмассивов данных. Результаты ПЛСпрогнозирования МС посредством мультисенсорной системы представлены вТабл.
VIII.2. Удовлетворительные коэффициенты корреляции и СКОК, ниже чемзначения ПДК МС в питьевой воде, открывают новые перспективы дляприменения данной потенциометрической мультисенсорной системы в областиэкологического мониторинга.Табл. VIII.2. Параметры регрессионных моделей для содержания МС в питьевойводе, [364].МС, мкг/лR2СКОК, мкг/л1.9-8.30.8800.03528 - 3000.9540.297Стандартный метод ЖХКолориметрический энзимный анализ1.9-8.30.9240.23128 - 3000.9171.181Табл. VIII.3.
Результаты ПЛС-ДА классификации образцовнетоксичного штаммов M. Aeruginosa, [364].Ожидаемый класстоксичного иНайденная принадлежность к классуTOXNTOXTOX92NTOX08не классифицирован54Была также показана возможность классификацию токсичного и нетоксичногоштаммов M. Aeruginosa с применением метода ПЛС-ДА (ПЛС-дискриминантныйанализ). Из 28 образцов, подверженных классификации, (14 фильтратов штаммовTOX и NTOX соответственно), корректная классификация была получена для 61%образцов, и этот предварительный результат является удовлетворительным сучетом небольшого набора обрабатываемых данных, Табл. VIII.3. Применениематематических методов коррекции дрейфа отклика сенсоров во времени224позволило достичь 100% корректной ПЛС-ДА классификации токсичного инетоксичного штаммов M. Aeruginosa, Табл.
VIII.4.Табл. VIII.4 Результаты ПЛС-ДА классификации образцовтоксичного инетоксичного штаммов M. Aeruginosa после коррекции дрейфа сенсоров [365].Данные без коррекциидрейфаСтандартизированныеданныеTOXNTOXTOXNTOXTOX167230NTOX710017Таким образом, эффективность мультисенсорного подхода для экспресс-оценкитоксичности воды была показана на примере применения потенциометрическоймультисенсорнойсистемынаосновечувствительныхматериалов,разработанных в настоящей работе, для качественной оценки и количественногоопределения микроцистинов.
Полученные результаты были сопоставлены срезультатами, полученными стандартными методами ЖХ и колориметрическогоферментативного анализа. Была продемонстрирована возможность успешногоприменения разработанного массива сенсоров для прогнозированияконцентраций МС, выделяемых цианобактериями в процессе их роста.VIII.3.2Разработка косвенного метода определения микроцистинаБыл также разработан косвенный метод определения МС с применениемодиночного оптического магний-селективного оптода на основе 1,10-бис((5фенил-8-гидрокси-7-хинолинил)метил)-1,10-диаза-18-краун-6-эфира, DCHQ-Ph,разработанного и подробно описанного в разделе VII.2. Суть метода косвенногоопределения МС состоит в регистрации подавления флуоресценции магнийселективного оптода, предварительно кондиционированного в растворе сизвестной концентрацией MgCl2 с фиксированным щелочным рН, при увеличенииконцентрации MC-LR, Рис.VIII.6.
Как упоминалось ранее, МС-LR являетсяциклическим пептидом, несущим в своей структуре две карбоксильные (от 1 DMe-Asp и 6-D-Glu) и одну иминогруппу от фрагмента 4 L-Ag, Рис.VIII.3. Взависимости от рН среды, МС может присутствовать в анализируемом растворе вразличных формах ионизации [352]. В частности, в щелочной среде MC-LR несетдвойной отрицательный заряд в связи с депротонированием карбоксильныхгрупп. Частицы MC-LR2- являются потенциальными лигандами для катионовметаллов за счет как электростатического взаимодействия, так и частичногокомплексообразования с амидными группами пептида, служащими донорамиэлектронной плотности.
Таким образом, варьируя рН среды возможно получить225частицы МС нужного заряда, которые в процессе конкурентного взаимодействияс целевым катионом магния будут уменьшать степень комплексации DCHQ-Ph иснижать флуоресцентный отклик оптода при увеличении концентрациимикроцистина.Рис.VIII.6 Схематическое представление метода косвенного определениямикроцистина: А) стабилизация мембраны в растворе 0.01 моль/л MgCl2 на фоне0.001 моль/л TRIS рН 8.6; Б) добавление MC-LR; В) поток ионов Mg2+ из фазымембраны, комплексация MC-LR с последующим снижением люминесценциичувствительной мембраны.VIII.3.2.1Анализ стандартов MC-LRДля определения МС на прозрачное предметное стекло были нанесены двечувствительные ПВХ-мембраны на основе DCHQ-Ph, пластифицированные ДОС сразличным количеством катионообменной добавки, ТпClФБК, в 5 и 10 % вес.,каждаявдвукратномповторении.Предварительномембраныкондиционировали в течение 15 минут в 0.01 моль/л растворе MgCl2 с цельюдостижения динамического равновесия между раствором и мембранной фазой; впроцессе кондиционирования регистрировали возникновение интенсивноголюминесцентного свечения чувствительных пленок, возникающего в процессекомплексации целевых Mg2+ ионов с DCHQ-Ph.
Оптический отклик мембран придобавлении МС тестировали методами прямой флюоресценции (ex=365 нм) иCSPT-LED, в котором в качестве источника светового возбужления служилточечный светодиод голубого цвета (380 нм). В обоих случаях былазарегистрирована линейная зависимость между понижением интенсивностиоптического сигнала мембрани концентрацией MC-LR в диапазоне-11-8концентраций от 10 до 10 моль/л, Рис.VIII.7.Такой оптический отклик мембран объясняли обратным потоком ионов2+Mg из фазы мембраны (первоначально насыщенной Mg2+, см.
Рис.VIII.6A) ипоследующим образованием комплексов MC-LR-Mg2+ на границе раздела фазраствор/мембрана, Рис.VIII.6Б,В. При анализе CSPT-LED нижний пределобнаружения MC-LR составил 0.05 мкг/л, что в 20 раз ниже ПДК в 1 мкг/л (всоответствии с нормами ВОЗ и СанПиН 2.1.4.1074-01 в питьевой воде).226500450400350A300[MC-LR]:1.7*10 -112502001501.5*10 -8100500400450500550600Г650Норм. Интенсивность люминесценцииНорм. Интенсивность флуоресценцииБыли также проведены исследования по оптимизации разработанногометода.
В частности, было исследовано влияние рН среды в различных буферныхрастворах (MЕS 5,5; HEPES 7.2 и TRIS 8.6) и концентрации MgCl2 (в диапазоне от10-6 до 3/2*10-2 моль/л) на отклик оптода к MC-LR. Оптимальные условияэксплуатации были установлены для 0.01 моль/л раствора MgCl2 на фоне 0.001моль/л TRIS с pH 8.6. Метод был апробирован для мониторинга выделениямикроцистина в различными штаммами сине-зеленых водорослей Microcystisaeruginosa и качественной оценки токсичности природных вод.БДлина волны, нмРис.VIII.7 Оптический отклик Mg2+-селективного оптода на увеличениеконцентрации MC-LR в фоне 0.01 моль/л TRIS pH 8.6 и 0.01моль/л MgCl2 (A) –изменение флуоресценции, ex=365nm; (Б) изменение люминесценции методомCSPT-LED, ex=380nm.VIII.3.2.2Качественная оценка токсичности природных водКачественную дискриминация токсичных и нетоксичных штаммов M.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
