Диссертация (1145490), страница 43
Текст из файла (страница 43)
СогласноВОЗ, наибольшую опасность и особый интерес при определении представляютсобой четыре гомолога МС: МС-LR, МС-RR, МС-LA и МС-YR [355].217Наиболее токсичным среди этих гомологов является MC-LR, содержащийфрагменты L-лейцин (L, фрагмент 2) и L-аргинин (R, фрагмент 4), и часто общееколичество микроцистинов в исследуемом образце представляется поотношению к содержанию MC-LR. Всемирная организация здравоохранения(ВОЗ) установила предварительную максимальную норму содержания MC-LR впитьевой воде на уровне 1 мкг/л [355].Рис.VIII.3 Химическая структура MC-LR.Стандартные инструментальные методы анализа МС основаны на методахразделения, таких как жидкостная хроматография (ЖХ) в сочетании с массспектрометрией или флуориметрией [ 356 , 357 ].
Широко используются такжесенсорные платформы с применением ферментов [358,359,360]. Основныминедостатками вышеуказанных методов являются необходимость в специальноми дорогостоящем оборудовании для проведения инструментального анализа, в товремя как нестабильность ферментов ограничивает возможности энзимныхсенсоров. При этом примеров применения применения безэнзимныхселективных сенсоров для прямого определения микроцистина в литературеочень немного, в основном такие сенсоры используют молекулярноимпринтированные полимеры (МИП) и обладают чувствительностью на уровнемкг/л [ 361-363]. Приготовление чувствительных материалов на основе МИПтрудоемко и требует присутствия аналита в процессе их синтеза (вокруг молекуланалита формируют МИП). Это в свою очередь приводит к добавочномузагрязнению среды и большим финансовым затратам.
В этой связи недорогие инетрудоемкие аналитические системы, способные осуществлять быструю инадежную оценку токсичности МС в пробах воды, становятся все болеевостребованными. Применение мультисенсорного анализа с использованиембезэнзимных неселективных сенсоров, отклик которых косвенным образомкоррелированссодержаниеманалитапредставляетсяинтересной218альтернативой стандартным методам анализа цианотоксинов. Применениетакой мультисенсорной системы, или «Электронного языка», состоящего из 8потенциометрическихсенсоров,содержащихэлектродыспластифицированными аниончувствительными мембранами на основеисследованныхметаллопорфириновыхионофоров,атакжекатиончувствительные датчики с халькогенидными стеклянными мембранами,для обнаружения МС в воде и распознавания различных штаммов сине-зеленыхводорослей Microcystis aeruginosa рассмотрено в настоящем разделе.Исследовались образцы водопроводной и природных вод, загрязненныеаликвотами неорганической питательной среды ВВМ, в которой на протяжении3-х месячного периода выращивали два штамма водорослей Microcystisaeruginosa: один токсичный (ТОХ), т.е.
выделяющий МС в процессе метаболизма,и один не токсичный (NTOX). Все образцы были исследованы с применениеммультисенсорной системы, а также содержание в них МС было проведеностандартным методом ЖХ с флуориметрическим окончанием и с применениемколориметрического энзимного метода, основанного на подавлении активностипротеинофосфатазы-2A (PP2A). Подробно детали эксперимента изложены вработе [364].VIII.3.1Выбор сенсоров в составе мультисенсорной системы дляскрининга микроцистинаВ процессе роста цианобактерии выделяют большое количество различныхметаболитов, мониторинг которых может быть полезным для детектирования иконтроля сине-зеленых водорослей.
Однако часто возможности такогомониторинга ограничены ввиду сложной биохимии бактериального роста иотсутствия селективных химических сенсоров для отдельных метаболитов. Вкачестве альтернативного подхода рассматривали общий качественный анализизменения параметров среды обитания цианобактерий в процессе их роста,который, косвенным образом может дать информацию также и об измененииконцентрационных профилей различных метаболитов. Для такого общегоанализа могут быть успешно применены потенциометрические сенсоры,обладающие высокой чувствительностью по отношению к различным ионнымчастицам и имеющие обычно нижние пределы обнаружения ниже 10-6 моль/л.При формировании массива потенциометрических сенсоров для обнаружения МСв воде и распознавания различных штаммов сине-зеленых водорослей Microcystisaeruginosa учитывали необходимость одновременного детектированиянаибольшего количества различных ионных частиц; в связи с этим в составмультисенсорной системы ввели сенсоры с ярко выраженной чувствительностьюпо отношению к различным катионам (C1, C2) , различным анионам (A1, A2, A3),а также сенсоры с отчетливой редокс-чувствительностью (CG-Cu, CG-Pb, CG-Ag), см.раздел II.5 для более подробной информации.219AЕ, мВВВМ : водаБЕ, мВВЕ, мВNTOX : водаTOX, [MC-LR]Рис.VIII.4 Отклик потенциометрических сенсоров в водопроводной воде, придобавлении: ВВМ среды (А), фильтратов выращенных в ВВМ штаммов M.Aeruginosa NON TOX (Б) и TOX (В), [364].220VIII.3.2Отклик отдельных сенсоров по отношению к микроцистинуНа Рис.VIII.4 показан отклик отдельных потенциометрических сенсоров вводопроводной воде, при добавлении увеличивающихся количеств ВВМнеорганической питательной среды, а также фильтратов штаммов NON TOX иTOX M.
Aeruginosa, выращенных в ВВМ среде. Представленные данныесоответствуют 80-му дню роста штаммов водорослей, когда количествовыделяемых метаболитов, и МС в частности должно быть существенным. Награфике отклик каждого из сенсоров отложен по отдельной оси, при этоммасштаб для всех осей сохраняли неизменным(40 мВ) чтобы иметь возможностьсравнить между собой отклики отдельных сенсоров. Как видно из графика,увеличение количества добавленного в водопроводную воду неорганическогопитательного буфера ВВМ не вызывало существенного изменения потенциаловсенсоров, Рис.VIII.4A.
Аналогичным образом, увеличивающееся количествофильтрата штамма NTOX M. aeruginosa не вызвало отчетливых изменений вотклике сенсоров, Рис.VIII.4Б. Напротив, добавление в водопроводную воду TOXфильтрата привело к значительным изменениям потенциалов сенсоров A1, A3, C2с полимерными ПВХ мембранами, а также всех халькогенидных стеклянныхсенсоров, Рис.VIII.4В.Такое поведение сенсоров связывали с изменением химического составасреды, и, в частности, с выделением водорослями микроцистина. В соответствиис данными высокоэффективной жидкостной хроматографии с детектором наоснове массива диодов, ВЭЖХ, количество MC-LR в изученном фильтрате ТОХсоставляло 75.4 мкг/л.
Таким образом, концентрация токсина в образцахрассчитанные с учетом разбавления была в диапазоне от 0.078 до 8.25 мкг/л.Ранее было показано, что при рН 7 МС проявляет высокую гидрофобность [352].В связи с такой высокой гидрофобностью, МС будет иметь тенденцию к переходуиз анализируемой водной среды и накоплению на поверхности полимернойорганической мембраны, тем самым оказывая влияние на потенциал сенсора. Вслучае халькогенидных стеклянных электродов, возможно электростатическоевзаимодействие между МС и положительно (сенсоры CG-Ag и Cu-CG) илиотрицательно (CG-Pb) заряженными мембранами. Такие взаимодействияприводят к снижению потенциала сенсоров, которое может быть в свою очередьскоррелировано с изменениями в химическом составе анализируемой среды, и ссодержанием МС-LR, в частности.
Исходя из этих соображений, в дальнейшихисследованиях использовали массив потенциометрических химических сенсоровдля выявления присутствия и определения содержания МС в природных водахпосредством методов хемометрического моделирования.221VIII.3.1Мониторинг роста цианобактерий и определение содержаниямикроцистинаVIII.3.1.1Калибровка массива сенсоров в стандартных растворах MC-LRПервоначально отклик массива сенсоров по отношению к MC-LR тестировали вего стандартных растворах в диапазоне концентраций от 0,1 до 10 мкг/л на фоневодопроводной воды. Для получения корреляции между откликом массива иреферентными данными о концентрации МС использовали метод ПЛС1.Нагрузки всех сенсоров были значительными и позволили получитьколичественную прогностическую модель. Коэффициент корреляции линейнойзависимости между откликом массива и концентрацией МС в процессе ПППвалидации данной модели приближался к единичному значению и составил R2=0.931, а среднеквадратичное отклонение прогнозирования, СКОП – 0.16 мкг/л.Полученные данныесвидетельствовали о возможности примененияисследуемой мультисенсорной системы для определения микроцистина вреальных объектах.VIII.3.1.2Анализ штаммов цианобактерий M.
aeruginosa.На следующем этапе изучали возможность определения гепатотоксинов,выделяемых природными штаммами цианобактерий Microcystis aeruginosa впроцессе их роста. Анализировали фильтраты питательной среды, в которойбыли выращены штаммы цианобактерий, в то время как собственно живыеклетки водорослей предварительно отделяли, чтобы исключить возможностьдальнейшего выброса их метаболитов в исследуемые образцы.
С цельюпрогнозирования концентраций МС были выбраны наиболее репрезентативныепериоды развития водорослей, соответствующие начальной стадии с низкимсодержанием выделяемых токсинов и конечному этапу, когда наблюдалось ихстарение и отмирание, сопровождающееся резким увеличением выбросатоксинов. Забор проб производился дважды в неделю, тестировали образцы всеми различных разбавлениях, таким образом количество исследованныхобразцов составило 168 для каждого штамма.Для получения корреляции между откликоммассива сенсоров иреферентными ЖХ данными о концентрации МС в исследованных растворахиспользовали метод ПЛС1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
