Диссертация (1145487), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Хорошо видно, чтопоследние практически отсутствуют в элюате, тогда как первые имеютсравнительно высокую степень извлечения. Следует отметить также болеевысокую специфичность выделения дифосфорилированных пептидов посравнениюсмонофосфорилированными,Причемдлямонофосфорилированных пептидов существует четкая зависимость междуИЭТ пептида и его степенью извлечения. чем ниже pI, тем выше степеньизвлечения.Сорбентсравнениявцеломпроявляетаналогичнуюспецифичность по отношению к разной степени фосфорилирования каждогопептида,однако,степенибольшинства пептидов ниже.(1)извлеченияприегоиспользованиидля2306.8 Исследование адсорбции гистидин-меченного белка на РММСCu(II)Как было указано выше, выбор металла для МАХ зависит от структурыанализируемых соединений.
Наряду с тем, что трехзарядные катионы, такиекак Al3+, Ga3+ и Fe3+ или четырехзарядныйZr4+ предпочтительны длясорбции фосфорсодержащих белков и пептидов, двухзарядные ионы Cu2+,Ni2+, Zn2+ и Co2+ используют для очистки гистидин-меченных белков.Для исследования процесса сорбции гистидин-меченного белка былиспользован рецепторный антагонист интерлейкина-36 с С-концевымгистидиновымтагом,имеющийаминокислотнуюпоследовательность,представленную на рисунке 6.8.1.Рис6.8.1.Аминокислотнаяпоследовательность рецепторныйантагонист интерлейкина-36 с С-концевым гистидиновым тагом.Подчѐркиванием отмечен гистидиновый таг.Изучение процесса адсорбции гистидин-меченного белка на РММСCu(II) было проведено при помощи метода атомно-силовой микроскопии(АСМ).
Исследования проводились так же, как и для исследованияадсорбции казеина на РММС Fe(III). Вначале проводилось сканированиеповерхности чистой подложки (кремния). Затем на чистую подложку потехнологии Ленгмюра-Блоджетт были перенесены 10 монослоев стеаратамеди(II).При сравнении рельефа кремниевой подложки и подложки снанесѐнными 10-ю монослоями стеарата меди видно, что так же как и в231случае РММС Fe(III) резко уменьшилась шероховатость поверхности., чтосвидетельствует о удачном переносе ПЛБ на подложку (6.8.2, 6.8.3).После этого полученные образцы были помещены в растворгистидин-меченого белка. Раствор выдерживали 30 минут, после чеготщательно промывали дистиллированной водой для удаления белка,непровзаимодействовавшего с поверхностью, ивновь просканировал спомощью АСМ.На приведѐнных изображениях видны участки, на которых произошлаадсорбция белка на поверхности РММС Cu(II).
При обработке РММС Cu(II)садсорбированнымгистидин-меченнымбелкомрастворомаммиака,наблюдается десорбция белка с поверхностиабвгРис 6.8.2. Исследование процесса сорбции/десорбции гистидинмеченного белка методом АСМ:а) изображение чистой подложки (безПЛБ); б) изображение подложки с нанесѐнными неколлапсированнымиРММС Cu(II); в) изображение РММС с нанесѐнными молекуламигистидин-меченого белка; г) подложка с нанесѐнным белком послепромывки раствором аммиака;232Плѐнкастеаратаперенесеннаяподложкумедина(II)кремниевуюпотехнологииЛенгмюра-БлоджеттОбразец с нанесѐнным гистидинмеченым белкомОбразецпоследесорбцииврастворе 0,4М NH4OHРис 6.8.3 Изображения стадий эксперимента в 3DВидно, что практически все раннее адсорбированные частицы,идентифицированные нами, как агрегаты белка, были удалены с поверхностисорбента .
Это делает обоснованным предположение, что данные структурымогут быть использованы в качестве металл – аффинных сорбентов впротеомных экспериментах.233На данном сорбенте была изучена адсорбция глифосата и продуктовего разложения. Глифосат – 2-[(фосфонометил)амино] уксусная кислота(рисунок 6.8.4 (А)) – послевсходовый, неселективный гербицид системногодействия, используемый для уничтожения однолетних и многолетнихсорняков на посевах и посадке многих полевых сельскохозяйственных,плодовых и цитрусовых культур, на виноградниках, в лесном и городскомхозяйстве, для уничтожения водных сорняков, а также для десикации листвыопределенных сельскохозяйственных культур.Основным метаболитом глифосата в почве, воде и растениях являетсяаминометилфосфоновая кислота (АМФК) (рисунок 6.8.4 (Б)).
По химическойструктуре АМФК очень близка к глифосату, однако она обладает слабойтоксичностью, но является метаболитом глифосата.АРис6.8.4.БСтруктурныеформулыглифосата(А)иаминометилфосфоновой кислоты (Б)Гербицид Раундап и другие препараты на основе глифосата широкоприменяются более чем 100 странах для уничтожениясорняков.
Это иобуславливает необходимость разработки методов для определения егоостатков в различных средах.Физико-химические свойства глифосата и его основного метаболитасоздают особые проблемы при разработке методов его определения вразличных матрицах. Молекула глифосата содержит три фрагментаразличной химической природы: фрагмент фосфоновой кислоты, вторичногоамина и карбоновой кислоты. Совокупность этих фрагментов в молекуле234приводит к тому, что глифосат практически нелетуч и, вследствие своейвысокойполярности,нерастворимвбольшинствеорганическихрастворителей.В составе молекул глифосата и АМФК отсутствуют хромофоры, чтоделает невозможным спектральное определение этих соединений в видимойчасти спектра.
Высокая растворимость глифосата и АМФК в воде (глифосат– 12 г/мл, АМФК – 0,058 г/мл) и сильная адсорбция частицами почвызначительно усложняет процедуру извлечения глифосата и его метаболита изразличных матриц и последующую очистку полученных экстрактов.Поэтому, как правило, определение этих соединений в сельскохозяйственноми продовольственном сырье и пищевых продуктах – процесс трудоемкий,сложный и дорогостоящий.Таблица 6.9Результаты количественного определения глифосата и АМФКСорбент НачальнаяФракцияКонцентрацияконцентрация (попослефосфору), мг/лэлюирования (пофосфору), мг/лглифосат АМФКРММСCu(II)0,1000,100глифосат АМФКпроскок0,4M0,0050,004водныйраствор 0,0330,018водныйраствор 0,0520,063аммиака0,1%пиперидинаСтепень экстракции(%)8581В результате проведенной металл-аффинной хроматографии сорбентомРММС Cu(II) с последующим количественным анализом методом атомно-235эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмойбылиполучены следующие экспериментальные данные (таблица 6.9 и рис 6.8.5),Рис 6.8.5.
Результаты проведения металл-аффинной хроматографии наРММС Cu(II) для глифосата и аминометилфосфоновой кислотыИсходя из полученных данных, можно сделать вывод о возможностивыделения глифосата и его основного метаболита (АМФК) из водныхрастворов с помощью РММС Cu(II) с последующим элюированием данныхсоединений.На основе полученных данных о составе и строении пленок ЛБ,содержащих ионы переходных металлов 3 периода, разработан новыйсорбентдляметалл-аффиннойхроматографии,обладающейвысокойэффективностью в протеомном анализе. Доказано, что специфичностьсорбентов хорошо объясняется теорией жестких и мягких кислот иоснований. Сорбенты, содержащие ионы Fe+3 (жесткая кислота) наиболееэффективен для фосфорилириованных белков. А содержащие ионы Cu+2(кислоты средней силы) для соединений, в состав которых входитгистидинмеченные белки.
Определены условия наиболее полного извлечениявышеназванных соединений из смесей для дальнейшего анализ.236Глава7. Электрохимические системы на основе ПЛБ,содержащих ионы железа7.1 Гибридные материалы, полученные непосредственно в ПЛБИзучениегибридныхматериалов,вкоторыхсочетаютсясвойстваорганических и неорганических соединений, набирает все большуюпопулярность.Такиематериалыполучаютпутемпрямогосинтеза,самоорганизации или методом Ленгмюра—Блоджетт.
Причем в последнемслучаевозможно получениепленокнепосредственно изгибридныхматериалов (например, производные ферроцена или порфиринов), илигибридные материалы синтезируют в ПЛБ (гексацианоферраты). В даннойчасти работы изученыповерхностные и электрохимические свойства ПЛБпроизводных ферроцена, а также монослоев, содержащих берлинскую лазурьи ее аналоги.Гибридные материалы на основе гексацианоферратов, полученныенепосредственно в ПЛБоктадециламина, синтезировались согласнометодике, описанной в гл 2.Для определения времени, необходимого дляобразования гексацианоферратов в монослое были изучены спектрыпоглощения смесей реагентов. Причем концентрации подбирались такимобразом, чтобы они были близки к концентрациям в ванне Ленгмюра (5 ×105моль/л, 10-4 моль/л). На рис.
7.1.1 представлены спектры поглощения взависимости от времени, прошедшего после смешения гексацианоферрата(II) калия и хлорида железа (III).2370,180,160,140,12D0,100,0870 мин0,060,040,021 мин0,00300400500600700800900, нмРис. 7.1.1. Спектры поглощения Fe4[Fe(CN)6]3 См = 10-4 моль/л.Гексацианоферрат железа окрашен в синий цвет, поэтому можнонаблюдать, как с течением времени увеличивается пик в районе 730 нм (Рис.7.1.2). Из зависимостей, представленных на Рис. 7.2 следует, что наобразование комплекса при низких концентрациях требуется 10 минут.Рис.
7.1.2. Зависимость оптической плотности раствора Fe 4[Fe(CN)6]3 отвремени. 1 – эквимолярная смесь См = 5×10-5 моль/л; 2 – эквимолярнаясмесь См = 1×10-4 моль/л.238Спектры поглощения гексацианоферрата меди в зависимости отвремени прохождения реакции представлены на Рис. 7.1.3. Пик, отвечающийобразованию этого комплекса, лежит в области коротких длин волн иперекрываетсяплечомпикажелеза,поэтомуобобразованиигексацианоферрата меди можно судить только по уменьшению концентрациигексацианоферрата калия.1,61,41,21,0D0,810,620,40,20,0300400500600700800900, нмРис. 7.1.3. 1 – спектр поглощения K3[Fe(CN)6] Cм = 5×10-4 моль/л, 2 –эквимолярная смесь реагентов K3[Fe(CN)6] и CuCl2 концентрации 5×10-4моль/л.Из спектров, приведенных на рис.
7.1.3 следует, что гексацианоферратобразуетсязначительносвидетельствуетбыстрее,совпадениечемспектровберлинскаядлявсехлазурь,значенийочемвременипрохождения реакции.Спектрыпоглощениягексацианоферратакобальта,полученногосмешением гексацианоферрата (III) калия и хлорида кобальта, представленынарис.7.1.4.Сгексацианоферрататечениемвремени(III) калиянаблюдаетсяи увеличениесглаживаниепикаинтенсивности окраскирастовора.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
