Диссертация (1145487), страница 27
Текст из файла (страница 27)
[82].207Рис 5.18 Определение Kb для ОДА на поверхности ПЛБ методомдвойного экстраполирования.СопоставимполученныйрезультатпорКbсданнымипоэлектрокинетики. На рисунке 5.17 видно, что именно начиная с рН 5.5-6наблюдается рост электрокинетического заряда.Интересен тот факт, что при исследовании поверхностных свойств МСОДА было установлено, что именно в этой области рН происходит резкоерасширение МС, что также объясняется увеличением числа ионизованныхгрупп (рис 5.19).208Рис.5.19 Поверхностные свойства МС ОДАв зависимости от рН субфазыНа рис 5.16 зависимости δ-рН для ОДА проходят через максимум, т.е.при рН< 4 наблюдается спад значений электрокинетического потенциала.Спад значений электрокинетического потенциала может быть объясненнейтрализацией части заряда ионами Cl- , вводимых в систему в составерегулятора рН, согласно реакции:RNH3+ + Cl- → RNH3+ …… ClТак как при рН<4 большая часть аминогрупп, способных присоединятьпротон, уже находится в ионизированном состоянии, то увеличениеконцентрации хлорид-иона будет однозначно смещать реакцию вправо, темсамым уменьшая заряд.Для подтверждения этой гипотезы были определены значения δпотенциала при фоновом электролите и регуляторе рН, анион которыхзаведомо хуже адсорбируется на поверхности (KNO3) .
В данном случаеследует ожидать смещение максимума в более кислую область. Именно это инаблюдается на рис 5.20. Однако введение в данный раствор Cl- , каксоставную часть регулятора рН, возвращает максимум в прежнее положение.209Рис 5.20 Зависимость ζ- потенциала ПЛБ ОДА от рН фоновогоэлектролита (KCl 10-3 моль/л)■- KCl 10-3 моль/л (регулятор рН HCl- NaOH)□- KNO3 10-3 моль/л (регулятор рН HNO3- NaOH)∆- KNO3 10-3 моль/л (регулятор рН HCl- NaOH)Таким образом, проведен цикл исследований электроповерхностныхсвойств ПЛБ на основе стаериновой кислоты и октадециламина.На основе полученных данных по электроповерхностным свойствам иморфологии поверхности доказана схожесть структур полученных двумяразличными методами: перенос монослоев с поверхности водной субфазы натвердую подложку и дисперсией коллапсированных на поверхности воднойсубфазы монослоев.
Это дает возможность проводить исследованияповерхностныхформированиесвойствструктурвтакихусловиях,прикоторыхперенесенной на твердую подложку ПЛБ затруднено илинеобходима большая площадь границы раздела фаз.210Полученные результатыповерхностного заряда иподтверждают механизм образованияреакции ,протекающиена поверхности ПЛБ,которые были предложены в 3 главе при изучении доли перехода кислоты всоль.211Глава 6Исследование адсорбционных свойств ПЛБВ последние годы активное развитие получают высокоспецифичные ивысокоселективные методы выделения органических и биоорганическихсоединений из биологических образцов и объектов окружающей среды. Впервую очередь, к таким методам можно отнести металл-аффиннуюхроматографию (МАХ). В основе этого хроматографического метода лежитразличное сродство органических соединений к ионам некоторых, чаще всегопереходных металлов.
Ионы металлов, в большинстве случаев, хелатируютполидентантными лигандами, иммобилизованными на вспомогательнойподложке(силикагель,агароза,сшитыйсополимерполистиролаидивинилбензола). Однако, возможен и другой механизм, когда ионы металлакрепкосвязанысвзаимодействоватьповерхностьюсорганическойанализируемымматрицейвеществом.Этимимогутусловиямудовлетворяют пленки Ленгмюра-Блдоджетт.Ионы металлов чаще всего классифицируются согласно теорииЖМКО. Жесткие кислоты (например, ионы Fe3+, Ca2+, Al3+) легче всегокоординируют кислород и фтор функциональных групп, мягкие кислоты(ионы Cu+, Hg+, Ag+) - к сере. Промежуточные по жесткости (Cu2+, Ni2+, Zn2+,Co2+) - к азоту, кислороду и сере.В данной части работы исследовалась адсорбция биологическихобъектов на ПЛБ, содержащие ионы трехвалентного железа (жесткиекислоты) и ионы Сu+2 (кислоты средней силы).6.1 Исследование процесса адсорбции фосфорилированного белка наПЛБнаосновестеаратажелеза(III)методоматомно-силовоймикроскопииДля установления возможности адсорбции на пленках Ленгмюра-Блоджеттстеарата железа(III) были проведены исследования процесса адсорбции212фосфорилированного белка при помощи атомно-силовой микроскопии.
Вкачестве объекта исследования был выбран казеин (casein Bos Taurus,молекулярная масса 18 кДа), поскольку данный белокнесколько сайтовфосфорилирования. Кроме того, данный белок легко и с высокой степеньючистоты может быть выделен из обезжиренного сухого молока коровы .Первоначальнобылопроведеносканированиеповерхностичистойкремниевой подложки (рисунок 6.1.1).
Затем на чистую подложку потехнологии Ленгмюра-Блоджетт были нанесены пленки стеарата железа(III)( рисунки 6.1.2,6.1.3 ).Рис6.1.1.Изображениечистойкремниевойподложкисоответствующий профиль поверхности для линии №100/256и213Рис 6.1.2 – Изображение подложки с нанесѐнными ПЛБ на основестеарата железа(III) и соответствующий профиль поверхности длялинии №100/200Рис 6.1.3 – Увеличенное изображение рисунка 14, 5 на 5 мкм214При сравнении рельефа кремниевой подложки и подложки снанесѐнными 10 монослоямиПЛБстеарата железа(III) видно резкоеуменьшение шероховатости поверхности, что свидетельствует об успешномпереносе пленки на подложку.После чего подложку с нанесенной пленкой поместили в растворказеина (концентрация 100 мкг/мл), выдерживали сутки, после чеготщательнопромывалидистиллированнойводой,дляудалениянепрореагировавшего с поверхностью казеина.
Результаты представлены нарисунках 6.1.4,6.1.5.Рис 6.1.4 – Изображение ПЛБ на основе стеарата железа(III) снанесѐннымимолекуламиказеина,исоответствующийпрофильповерхности для линии №115/255На поверхности ПЛБ видны участки, на которых произошла адсорбциячастицказеина,причѐмразмерысоответствуют200-500нм.Дляисследования возможности применения данных структур в качествесорбентов необходимо проверить могут ли адсорбированные молекулыдесорбироваться с поверхности. Так как адсорбция проводилась в кислыхрастворах, то десорбцию целесообразно проводить в щелочной среде.
С этой215целью образцы были помещены в раствор аммиака, после чего вновьсканированы с помощью АСМ. Результаты представлены на рисунке 6.5.Рис 6.1.5 – Изображение ПЛБ на основе стеарата железа(III) снанесѐнным белком после промывки раствором аммиака, 15 на 15 мкмВидно, что почти все ранее адсорбированные частицы были удалены споверхностиобразца.Успешнаяадсорбцияидесорбцияфосфорилированного белка в условиях, соответствующих классическомуметалл-аффинномуанализу,доказываетвозможностьиспользованияисследуемых ПЛБ в качестве металл-аффинного сорбента.Таким образом, полученные ПЛБ на основе стеарата железа(III) можноусловнообозначитькакрегулярныймультимолекулярныйсорбент,содержащий железо(III) – РММC Fe(III).6.2. Адсорбция белка на ПЛБ Fe(III)Для исследования адсорбции белков на поверхности ПЛБ Fe(III) былипостроены изотермы сорбции казеина (casein Bos Taurus, молекулярная масса18 кДа).
Для количественного анализа казеина использовали методБредфорд, основанный на взаимодействии белка с кислым красителемКумасси G-250. Концентрация образующегося окрашенного комплекса216пропорциональна концентрации белка в пробе, что позволяет успешнопровести его количественный анализ в растворе для низких концентраций сдостаточной степенью точности.При построении калибровочного графика было определено, чтообласть линейности детектирования для казеина наблюдается в диапазоне от0 до 120 мкг/мл (то есть от 0 до 0.0066 мкмоль/мл).
Поэтому в пределахданного диапазона были приготовлены растворы, которые инкубировали содинаковым количеством сорбента при 20ºС и затем по методу Брэдфордизмеряликонцентрациюнесорбированногобелка.Пополученнымэкспериментальным данным были рассчитаны значения адсорбцииипостроены зависимости адсорбции Г от молярной концентрации белка врастворе после адсорбции (Св растворе) .Рис 6.2.1. – Изотерма сорбции казеина на ПЛБ Fe(III)при 20ºСПри малых концентрациях белка максимальное значение величинысорбции составляет 0.17 мкмоль/г, после которого значение сорбции остаетсяпрактически неизменным вплоть до концентрации белка в растворе 0.0025мкмоль/мл, при котором значение сорбции резко возрастает ( рисунок 6.2.1).217Полученная зависимость величины адсорбции от концентрациикомпонента в диапазоне 0-0.0025 мкмоль/мл может быть описана в рамкахтеории адсорбции Ленгмюра; на начальном участке изотермы наблюдаетсярезкоевозрастаниемономолекулярнойвеличинысорбциейадсорбции,белканачтоможноповерхностиобъяснитьсорбента.Придальнейшем увеличении концентрации белка в растворе до некоторогозначения, происходит насыщение поверхности, при последующей адсорбциидостигается второе плато.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
