Диссертация (1145487), страница 28
Текст из файла (страница 28)
Второе плато на изотерме может быть связано собразованием второго слоя за счет белок-белковых взаимодействий.На основании построенных изотерм сорбции можно сделать вывод, чтоПЛБ Fe(III) может рассматриваться в качестве сорбента, так как при низкихконцентрациях аналита наблюдается практически полная сорбция и выход наплато насыщения наступает при достаточно высоких концентрациях белка висходном образце.6.3 Термодинамические характеристики адсорбции белкаДля расчета основных термодинамических функций процесса сорбциибелка казеина на ПЛБ Fe(III) на изотермах сорбции, полученных ранее, быливыбраны четыре концентрации. Адсорбцию проводили при добавлении ксорбентам выбранных концентраций белка при трех различных температурах(20°С, 30°С, 40°С) (рисунок 6.3.1 таблица 6.1).
Используя линеаризованноеуравнение Ленгмюра (Cв растворе/Г = 1/(Г∞·К) + С/Г∞, ) и изотермы Вант-Гоффа(ΔH°-TΔS° = -RT·lnK ) , были рассчитаны основные термодинамическиепараметры адсорбции казеина на на ПЛБ Fe(III). Результаты представлены втаблице 6.2.218Рис 6.3.1 – Изотермы сорбции казеина на РММС Fe(III)при 20ºС, 30ºС,40ºСТаблица 6.1 – Значения концентраций и величины адсорбции казеина до ипосле адсорбции на РММС Fe(III)при различных температурахТемпература, ºС Cисх, мкг/мл Cв растворе, мкмоль/мл Г, мкмоль/г20000200.00020.08400.00060.15500.00100.16600.00150.16700.00200.16800.00250.18900.00250.221000.00270.26219Температура, ºС Cисх, мкг/мл Cв растворе, мкмоль/мл Г, мкмоль/г1200.00330.30400.00030.17500.00080.18600.00130.18700.00180.18400.00020.18500.00060.19600.00110.20700.00170.193040Таблица 6.2 – Значения величин К, ΔH0 и ΔS0 при проведении сорбцииказеина на РММС Fe(III)при 20ºС, 30ºС, 40ºСТ, ºСРММС Fe(III)К2011607305360840255740среднеесреднееΔH0,ΔS0,кДж/мольДж/моль·К-117 ± 590 ± 122206.4.Определение сорбционной емкости РММС Fe(III)Важнейшей характеристикой сорбента является его сорбционнаяемкость, поскольку именно она определяет значимость сорбента дляпрактического применения.
Казеин является сложной белковой молекулой,поэтому в качестве модельного объекта был выбран фосфорилированныйпептид с аминокислотной последовательностью SSNGHV(pY)EKLSSI ификсированной молекулярной массой 1499 Да. В качестве сорбентасравнения был выбран коммерческий гель PHOS-Select Iron Affinity Gel(Sigma Aldrich), содержащий железо(III), с заявленной емкостью до0.3 мкмоль/г сорбента.Одним из основных аналитических инструментов биоорганическогоанализа является сочетание методов хроматографии и масс-спектрометрии(ВЭЖХ-МС с ионизацией при атмосферном давлении). Поэтому методомколичественногоопределенияпептидавпроскокебылавыбранавысокоэффективная жидкостная хроматография с ультрафиолетовым и массспектрометрическимдетектированием.УФ-детектированиепозволяетпроводить количественный анализ, а идентификация проводится по данным смасс-спектрометрического детектора.Послемасс-спектрометрическойидентификациипептидаSSNGHV(pY)EKLSSI, для количественного анализа образцов до и послесорбции пептиданасорбентах использовали методдетектированием (рисунок 6.4.1).ВЭЖХсУФ221АРисунок6.4.1–А:БхроматограммастандартногораствораSSNGHV(pY)EKLSSI в концентрации 1 мг/мл; Б: хроматограммапроскока после металл-аффинной хроматографии на РММС Fe(III)Пептид был взят с заведомым избытком , чтобы добиться насыщениясорбента .
Содержание пептида определяли методом ВЭЖХ-УФ . По егосодержанию в проскоке рассчитывали удельную сорбционную емкость наплощадьмонослоястандартизации.(мкмоль/дм2).Затем,используярезультатырассчитали удельную сорбционную емкость на массусухого сорбента. Результаты представлены в таблице 6.3.Таблица 6.3 – Сорбционная емкость РММС Fe(III)Удельнаясорбционная ПерваяВтораяТретьяСреднееемкость, выраженная в:сериясериясериязначениемкмоль/дм20.000960.000980.000980.001 ± 0.001мкмоль/мг0.0340.0350.0350.035 ± 0.001УдельнаясорбционнаяемкостьРММСFe(III)попептидуSSNGHV(pY)EKLSSI составляет не менее 0.03 мкмоль/мг, что значительнопревышает емкость коммерческого сорбента (до 0.0003 мкмоль/мг).2226.5 Изучение специфичности сорбции пептидов, фосфорилированныхпо различным аминокислотамВ фосфорилированных пептидах остаток фосфорной кислоты можетбыть присоединен к трем аминокислотным остаткам: серина (S), треонина(T), тирозина (Y).
Следовательно, можно ожидать, что пептиды с разнымисайтами фосфорилирования будут взаимодействовать с исследуемымисорбентами неодинаково. Для проверки этой гипотезы были выбранысинтетические фосфорилированные пептиды SSNGHV(pY)EKLSSI (ранееиспользуемый при определении сорбционной емкости ПЛБ Fe(III)) иFGE(pS)AGAAS и его нефосфорилированный аналог FGESAGAAS. Всепептиды были взяты в равных количествах со значительнымизбытком,чтобы по их содержанию в проскоке оценить долю адсорбированныхпептидов. Общее количество пептидов (60 мкг, по 20 мкг каждого) в 2 разапревышало нагрузку, выбранную при определении сорбционной емкостисорбентов, при том же количестве сорбентов .
Методика экспериментапредставлена в гл2, количественный анализ проводили методом ВЭЖХ-МС.Усредненные результаты по трем повторениям представлены в таблице 6.4.Таблица 6.4 – Содержание адсорбированных пептидовАдсорбция относительно начальной нагрузки, %ПептидРММС Fe(III)SSNGHV(pY)EKLSSI 67 ± 2FGE(pS)AGAAS52 ± 2FGESAGAAS9±1Как и следовало ожидать, к РММС Fe(III)имеютразличнуюспецифичность:наисследуемые пептидыПЛБFe(III)пептид,фосфорилированный по тирозину, сорбируется в более высокой степени, чем223фосфорилированный по серину.Это объясняется тем, что в тирозинегидроксильная группа, по которой идет фосфорилирование, отделена откарбоксильной и аминной групп бензольным кольцом. Что приводит кактивации фосфорилированного фрагмента.
Нефосфорилированный пептидадсорбируется значительно хуже.6.6 Термодинамические характеристики сорбции пептидов на РММСFe(III)Для подтверждения выявленных закономерностей, был произведенрасчет основных термодинамических функций процесса адсорбции пептидовSSNGHV(pY)EKLSSI и FGE(pS)AGAAS на РММС Fe(III). Экспериментпроводился также, как и для казеина. Изотермы представлены на рисунках6.6.1 и 6.6.2; результаты представлены в таблицах 6.5, 6.6 .Рис 6.6.1 – Изотермы адсорбции пептида SSNGHV(pY)EKLSSI при 20ºС,30ºС и 40ºС на РММС Fe(III)224Рис 6.6.2 – Изотермы сорбции пептида FGE(pS)AGAAS при 20ºС, 30ºС и40оСна РММС Fe(III)225Таблица 6.5 – Значения концентраций и величины адсорбции пептидаSSNGHV(pY)EKLSSI до и после адсорбции на РММС Fe(III) при различныхтемпературахСорбентТемпература,Cисх,ºСмкг/млCв растворе, мкмоль/мл Г, мкмоль/г250.0190.023300.0390.024350.0620.025400.0950.026000100.0010.012200.0030.023250.0090.029300.0190.032350.0480.032400.0760.034450.1100.034500.1400.034600.1520.036250.0150.039300.0350.040350.0530.041400.0850.04140РММСFe(III)3020226Таблица 6.6 – Значения концентраций и величины адсорбции пептидаFGE(pS)AGAAS до и после адсорбции на РММС Fe(III)при различныхтемпературахСорбентТемпература,Cисх,ºСмкг/млCв растворе, мкмоль/мл Г, мкмоль/г200.0650.016250.0880.016300.1120.017350.1620.017000100.0230.010200.0420.016250.0900.018300.1090.018350.1250.018400.1480.018450.1600.018500.1790.019600.2110.020200.0670.020250.0980.020300.1320.021350.1720.02140РММСFe(III)3020227Таблица 6.7 – Значения величин К, ΔH0 и ΔS0 при проведении сорбциипептидов на РММС Fe(III)при 20ºС, 30ºС, 40ºССорбентПептид,t ºСК,мл/мкмолΔH0,ькДж/моль Дж/моль·К20955330505РММС440243Fe(III)2201543307444039SSNGHV(pY)GKLSSIFGE(pS)AGAASΔS0,-16.8±254±9-8.6±165±9Термодинамические расчеты подтвердили выявленную специфичностьсорбентов по отношению к пептидам, фосфорилированным по различнымаминокислотам.6.7 Изучение специфичности сорбции на примере смеси различныхфосфорилированных пептидовСледующимшагомсталоисследованиесмесипептидов(нефосфорилированных и фосфорилированных по разным аминокислотам), аименно:смесь8пептидов-фрагментовтау-белка,пептидыSSNGHV(pY)EKLSSI, FGE(pS)AGAAS и FGESAGAAS (таблица 6.8).Для проведения металл-аффинной хроматографии все пептиды быливзяты в равных количествах .
Количественный анализ трех параллельныхэкспериментов проводили методом ВЭЖХ-МС. В качестве сорбентасравнения был выбран коммерческий железо(III)-содержащий гель PHOSSelect™ Iron Affinity Gel (Sigma Aldrich).228Таблица 6.8 – Набор синтетических пептидов[M+H]+№Аминокислотная последовательность пептида pI1SRTPSLPTPPTREPK10.83 1663.9131pSRpTPSLPTPPTREPK7.071743.8791pp SRpTPpSLPTPPTREPK5.051823.8462VAVVRTPPKSPSSAK11.17 1523.8912pVAVVRpTPPKSPSSAK8.671603.8572pp VAVVRpTPPKpSPSSAK6.981683.82435.352215.1003pp TDHGAEIVYKpSPVVSGDTpSPR4.032375.0324FGESAGAAS4.00796.3454pFGEpSAGAAS3.30876.3145pSSNGHVpYEKLSSI7.821500.673TDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRВсе используемые сорбенты были взяты в равных количествах по массесухого вещества.229Iron Affinity GelРММСFe(III)Рис 6.7.1 – Диаграммы степеней извлечения синтетических пептидовпосле металл-аффинной хроматографии на РММС Fe(III).и Iron AffinityGelАнализ, проведенный методом металл-аффинной хроматографии воптимизированных условиях с последующим ВЭЖХ-МС детектированиемпоказал, что исследуемый сорбент демонстрирует высокую селективность кфосфорилированным пептидам (1р, 1рр, 2р, 2рр, 3рр, 4р, 5р) по сравнению снефосфорилированными (1, 2, 3, 4) (рисунок 6.7.1 ).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
