Автореферат (1144819), страница 8
Текст из файла (страница 8)
К таким микроРНК относятся и11 микроРНК C19MC кластера. Для восьми из них (miR-515-3p, miR-515-5p, miR-516a-5p, miR518c-3p, miR-518f-3p, miR-519e-5p, miR-520a-3p, miR-524-3p) ранее была показана повышеннаяэкспрессия в плацентах женщин с гестозом (Ishibashi et al., 2012; Wang et al., 2012; Zhu et al., 2009;Xu et al., 2014). Но для трех (miR-518a-3p, miR-518a-5p, miR-518e-3p) – такая ассоциация былаустановлена впервые.Рис.6.Сравнениеспектров микроРНК вплаценте при гестозе и внорме.Следует отметить, что некоторые микроРНК ранее были обнаружены не только в плаценте,но и в крови беременных женщин.
MiR-515-3p, miR-515-5p, miR-518c-3p и miR-518e-3p находилив плазме беременных женщин, но не детектировали на следующий день после родоразрешения(Miura et al., 2010). Концентрация miR-515-5p, miR-518a-3p, miR-518a-5p, miR-518e-3p, miR-519e5p и miR-524-3p в сыворотке крови была существенно выше в третьем триместре беременности всравнении с таковой у небеременных женщин (Gilad et al., 2008). Янг с коллегами (Yang et al.,2011) обнаружил повышенную экспрессию miR-518e в сыворотке крови пациенток спреэклампсией по сравнению с контролем, а Ли с коллегами (Li et al., 2013) выявил подобныеизменения для miR-515-3p. Эти находки свидетельствуют о том, что микроРНК могут статьудобными прогностическими биомаркерами развития гестоза.В дополнении к микроРНК C19MC кластера в плаценте рожениц с гестозом на фонегипертонии была выявлена дисрегуляция еще восьми микроРНК (miR-210, miR-195, miR-223,miR-1, miR-34c, miR-193b, miR-let-7f, miR-31).
MiR-210, ответственная за функцию митохондрийплаценты (Muralimanoharan et al., 2012), является одним из самых значимых маркеров гестоза22(Pineles et al., 2007; Zhu et al., 2009; Enquobahrie et al., 2011; Ishibashi et al., 2012; Xu et al., 2014;Luo et al., 2014; Weedon-Fekjær et al., 2014). Такая связь обнаружена во многих работах. Уровеньэкспрессии miR-210 существенно повышен в плаценте больных гестозом женщин по сравнению снормой (Gunel et al., 2011; Zhang et al., 2012; Xu et al., 2014). Было так же установлено, чтоповышенная экспрессия miR-210 может быть индуцирована гипоксией тканей плаценты, амикроРНК miR-210 является маркером именно этого состояния (Zhu et al., 2009).
Важно, чтолокальная гипоксия и ишемия плаценты являются важным патофизиологическим механизмом,запускающим развитие гестоза (Zhu et al., 2009). Таким образом, выявленные в данной работезакономерности не только подтверждают полученные ранее данные, но и конкретизируют связьповышенной экспресии miR-210 с развитием гестоза на фоне имеющейся гипертонии.В настоящем исследовании в плаценте рожениц с гестозом на фоне гипертонии обнаруженоснижение экспрессии miR-195, что согласуется с данными ряда авторов (Zhu et al., 2009; Bai et al.,2012; Xu et al., 2014). Однако, наши результаты противоречат исследованию плацент от рожениц стяжелым гестозом, где уровень экспрессии данной микроРНК напротив повышен (Hu et al., 2009).Повышенная экспрессия miR-195 провоцирует инвазию трофобласта путем репрессированиясекреции белка ACVR2A (Bai et al., 2012). Сниженная экспрессия данной микроРНК приводит кувеличению синтеза белка ACVR2A, следствием чего является нарушение инвазии трофобласта ипроцесса ремоделирования спиральных артерий, что хорошо согласуется с центральнойпатофизиологической гипотезой развития гестоза (Bai et al., 2012).
Данный факт особенно важен,так как ген ACVR2A является одним из генов-кандидатов преэклампсии.Согласно базе данных miRDB (http://mirdb.org), мРНК гена ACVR2A может быть мишеньюдля miR-223, уровень экспрессии которой также снижен в плаценте женщин с гестозом.Сниженная экспрессия miR-223 на фоне преэклампсией показана ранее во многих работах (Zhu etal., 2009; Yang et al., 2011; Ishibashi et al., 2012; Choi et al., 2013; Xu et al., 2014) в тканях плаценты,но и при анализе крови беременных женщин с патологией (Yang et al., 2011; Li et al., 2013). Болеетого, низкий уровень экспрессии данной микроРНК более характерен для раннего гестоза(Weedon-Fekjær et al., 2014).
Благодаря связи miR-195 и miR-223 с регуляцией экспрессии генаACVR2A, их исследование представляется одним из приоритетных направлений в поиске наиболеезначимых маркеров гестоза.Исследование роли микроРНК при гестозе находится на начальной стадии. Полученныеартефакты и результаты, подтверждающие предыдущие данные, свидетельствует о том, что визучении микроРНК в настоящее время идет лишь накопление данных и однозначные выводыпреждевременны (Fu et al., 2013).Исследование метилирования промоторных регионов гена H19 в плаценте при гестозе и вконтроле. Имеются данные о том, что метилирование промоторного региона гена H19 можетиграть роль в развития гестоза (Yu et al., 2009; Gao et al., 2011).
Нами исследованы двапромоторных региона гена H19 тремя методами: МЧ-ПЦР, МСП и КОБРА. Совместноеиспользование данных методов было продиктовано необходимостью исследовать внутрипромотора максимальное число CpG сайтов, относящихся, к так называемым, DMR регионам(дифференциально метилированным регионам).На рис. 7 представлены электрофореграммы ПЦР-продуктов плаценты от женщин сгестозом, полученные после проведения МЧ-ПЦР первого района гена H19. Как видно из рис.
7,ПЦР-продукт, соответствующий гену H19, выявлен только после обработки эндонуклеазойрестрикции Hpa II, а не MspI. Это доказывает, что все цитозины данного региона гена H19метилированны.Оценку метилирования района 2 гена H19 проводили методом МС-ПЦР. ПЦР продукт,соответствующий данному району, выявлялся только при использовании m-праймеров, а не uпраймеров, что свидетельствовало о метилированным состоянии участка 2 гена H19.
Для оценкистатуса метилирования обоих районов гена H19 использовали комбинированный бисульфитнорестрикционный анализ. Цитозиновые нуклеотиды второго района этого гена метилированы, апервого района представлены аллелями, различающимися по метилированию. Таким образом,полученные результаты подтверждают данные о метилированном состоянии промоторной областигена H19 в клетках хориона при гестозе.
Однако в связи с тем, что метилированы были не тольковсе образцы плацент женщин с гестозом, но и все образцы контрольной группы пациентов,полученные результаты не позволяют утверждать о вовлеченности в гестоз метилированиярегионов данного гена.23Рис.7.ЭлектрофореграммаПЦР-продуктовпромоторныхрегионов генов H19 (район 1),RASSF1A и LPL после обработкиДНКрестриктазамиHpaIIиMspIС одной стороны, данный факт можно объяснить тем, что мы, в отличие от зарубежныхавторов (Gao et al., 2011), не дифференцировали гестоз на ранний и поздний. Но в нашемэксперименте все образцы были метилированы однотипно, что исключает, возможностьподобного предположения.
Следует иметь в виду, что в работе Гао с коллегами проводиликоличественный анализ статуса метилирования всей DMR области гена H19, тогда как мыисследовали только отдельные CpG островки этого региона. Кроме того, имеются данные,которые не подтверждают роль метилирования промоторного региона гена H19 в развитии гестоза(Bourque et al., 2010). Следовательно, вклад метилирования локуса гена H19 в развитие гестоза неочевиден.Таким образом, как традиционные «классические» подходы (анализ частот аллелей, ихкомбинации), так и математические модели оценки риска позволили подтвердить ассоциацию сгестозом ряда известных генов-кандидатов и установить наличие многих других неслучайныхассоциаций. Эти подходы не позволяют с уверенностью предсказать индивидуальный рискразвитие гестоза, но дают достаточно оснований для формирования групп повышенного рискапо этой частой патологии. Новые маркеры гестоза были выявлены при анализе гена-кандидатагестоза – ACVR2A, и изучении пула микроРНК образцов плаценты.
Полученные данныеподтверждает сложную природу патогенеза гестоза, развивающегося вследствие нарушениявзаимодействия продуктов материнского и плодного геномов.Наследственные маркеры артериальной гипертензии и метаболического синдрома сожирением у детей.Сравнительный анализ частот аллелей и их комбинаций. С помощью биочипов: «Кардиобиочип» (Глотов и др., 2007), и методом ПЦР-ПДРФ изучены полиморфные сайты следующих 11ти генов: REN (-83G>A), AGT (M235T), AGTR1 (1166A>C), AGTR2 (3123C>A), BDKRB2 (-58T>C),ADRB2 (48A>G, 81C>G), MTHFR (677C>T), APOE (E2, E3,E4), LPL (Ser447Stop), NOS3 (-786T>C),ACE (I/D).
Сравнительный анализ частот комбинаций аллелей и аллелей генов-кандидатов у детейс АГ и детей контрольной группы позволил выявить ассоциацию с АГ одного из генов-кандидатов– гена AGTR2 (p<0,001). В группе контроля чаще, чем у детей с АГ встречается гетерозиготныйгенотип - C/A (p<0,001; ОШ=0,39), тогда как генотип A/A превалирует у детей с АГ, то естьявляется фактором риска АГ (p=0,004; ОШ=1,91).
При разделении по полу такая тенденциясохранилась только для мальчиков (p=0,008; ОШ=1,99) (см. табл. 10). При изучениираспределения частот комбинаций аллелей для гена AGTR1 раздельно по полу у мальчиковконтрольной группы выявлено преобладание протективного генотипа A/C по сравнению сбольными АГ (p=0,033; ОШ=0,55).
Различия в частотах вариантных аллелей и их комбинациймежду выборкой детей, больных АГ или МС и контрольной выборкой при разделении по полубыли отмечены и для других генов. В частности, было показано, что существуют статистическизначимые различия в частотах аллелей гена APOE между девочками с АГ и школьницамиконтрольной группы (табл. 11).
Аналогичные закономерности были установлены и дляполиморфизма -786T>C по гену NOS3. У школьниц было обнаружено преобладание генотипа T/Cпо сравнению с девочками, больными АГ (p=0,003; ОШ=0,12). Различия частот аллелей, но некомбинаций аллелей гена AGTR2 были найдены при сравнении девочек группы МСО и контроля(p=0,06, χ2=5,65 и p=0,05, χ2=3,84) (см. табл. 12).
У данной группы по сравнению с контролемпреобладала аллель А (ОШ=0,67; 95%ДИ: 0,45-1,00). У девочек с МСО (табл. 12) обнаруженопреобладание аллели С гена LPL в отличие от контрольной группы школьниц (p=0,048; ОШ=2,35).Таблица 10.24Значения коэффициента отношения шансов по частотам аллелей и их комбинаций длягенов AGTR1, AGTR2 в группе мальчиков с АГ по сравнению с контрольной группой.ГенАллели /комбинацииаллелейДети сАГ, NШкольники, NЗначениеpЗначениеОШскорректиро(95% ДИ)ванного pAGTR1Аллели, числоA2011900,0720,2881,49 (0,96-2,32)C49680,0720,2880,67 (0,43-1,04)Комбинации аллелей, числоA/A8268A/C3754*0,0330,2750,55 (0,31-0,97)C/C670,5761,0000,71 (0,19-2,61)AGTR2Аллели, числоC108146*<0,001*0,0020,50 (0,34-0,73)A14298*<0,001*0,0021,99 (1,37-2,90)Комбинации аллелей, числоC/C5473A/A7149*0,0080,1001,99 (1,17-3,42)Примечание: - комбинации аллелей сравнения; *- статистически значимые значения.Таблица 11.Значения коэффициента отношения шансов по частотам аллелей и их комбинаций длягенов APOE, NOS3 в группе девочек с АГ по сравнению с контрольной группой.ГенАллели /комбинацииаллелейДети сАГ, NE2E3E42735E2/E20E2/E3E2/E4E3/E3E3/E4E4/E4203350TC866APOENOS3Школьники, NЗначениеpЗначениескорректированного pАллели, число110,2280,53214025*0,0390,188Комбинации аллелей, число0отсутствуеотсутствуетт100,2000,65111,0001,00051180,1450,62830,2850,759Аллели, число1420,5700,900200,5700,900ОШ(95% ДИ)0,33 (0,03-1,55)0,36 (0,10-1,01)отсутствует0,31 (0,03-1,60)0 (0-61,40)0,43 (0,11-1,36)0,00 (0,00-3,95)0,85 (0,47-1,55)1,18 (0,65-2,13)Комбинации аллелей, числоT/T4164T/C414*0,003*0,0430,12 (0,01-0,58)C/C361,0001,0000,97 (0,14-5,22)Примечание: - комбинации аллелей сравнения; *- статистически значимые значения.Таблица 12.Значения коэффициента отношения шансов по частотам аллелей и их комбинаций длягенов AGTR2, LPL у девочек группы МСО и в контрольной группе.ГенАллели /комбинацииаллелейДети сМС, NCA6985C/CC/AA/A173525AGTR2LPLШкольники, NЗначениеpЗначениескорректированного pАллели, число181*0,0410,165145*0,0410,165Комбинации аллелей, число48850,8661,000300,0560,311Аллели, числоОШ(95% ДИ)0,67 (0,45-1,00)1,49 (1,37-2,90)1,10 (0,54-2,29)2,21 (0,97-5,10)25CG1348142*0,0480,1652,35 (0,95-6,39)20*0,0480,1650,43 (0,16-1,05)Комбинации аллелей, числоC/C6364C/G8140,3550,8720,58 (0,20-1,61)G/G030,2450,7410 (0-2,55)Примечание: - комбинации аллелей сравнения; *- статистически значимые значения.Таким образом, аллели генов APOE, NOS3 ассоциированы с риском развития АГ у девочек, ааллели генов AGTR1 и AGTR2 - с риском развития АГ у мальчиков, в то время как варианты геновAGTR2 и LPL - с риском развития МС у девочек.Анализ ассоциации показателей ИМТ, САД, ДАД и вариантов генов у детей с артериальнойгипертензией.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
