Автореферат (1144819), страница 7
Текст из файла (страница 7)
5). Были так же выделены специфичные факторы риска.Наибольшее число связей отмечено для генов TNFA, TGFB1, INS. Эти гены, как было установлено,участвуют во многих процессах с высоким индексом CR, таких как: позитивная регуляциясигналинга протеинкиназы B, регуляция митоза, регуляция деления ядра и другие (Glotov et al.,2015). Ассоциативная сеть генов и белков, общих для анализируемых заболеваний, включала 67генов и 167 связей (Glotov et al., 2015).
Специфичными факторами риска гестоза в данной сетиоказались: ген интерлейкина 1В (IL1B), ген эндотелиальной NO-синтазы (NOS3), ген белкатеплового шока 4 (HSP74), ген аполипопротеина J (CLU), 5,10-метилентетрагидрофолат редуктаза(MTHFR). Исходя из анализа ассоциативных сетей, можно считать, что в отличие от СД, ГД, ОЖ,именно эти гены следует рассматривать как дифференцированные факторы риска гестоза. Можнопредполагать, что метаболический путь, нарушения которого ведут к гестозу, «стартует» с общихгенов - TGFB1, TNFA, INS, ACE, нарушает экспрессию генов IL1B, NOS3, HSPA4, CLU, MTHFR иманифестирует как прогрессирующее осложнение беременности - гестоз (ПЭ). Не исключены идругие сценарии молекулярного патогенеза гестоза (ПЭ): TGFB1 или TNFA - IL1B - ПЭ; TNFA илиINS - NOS3 - ПЭ; INS – HSPA4 или CLU - ПЭ; ACE - MTHFR – ПЭ.
Следовательно, в зависимостиот аллельных вариантов кандидатных генов и провоцирующих экзогенных факторов начальныестадии патогенеза гестоза могут быть различными, однако, начиная с ранних этапов, процессстановится канализированным и, в конечном счете, проявляется в виде характерной для гестозаклинической триады: гипертония, нарушения почек и отеки.Применение генных сетей позволило не только установить общие и специфичные факторыриска гестоза, но и предположить определенные патофизиологические пути развития этого19заболевания.
Последнее представляет большое значение для практики, т.к. позволяетпредположить (а значит - предотвратить) процессы перехода одной патологии в другую.Рис.5.Ассоциативнаясеть генов ибелков,общаядлягестоза(слевавнизу),сахарногодиабета(слевавверху),ожирения (справавверху) и диабетабеременных(справавнизу)(по Glotov et al.,2015).Секвенирование гена ACVR2A у женщин с гестозом и у женщин с физиологическойбеременностью. Для комплексного изучения новых маркеров гестоза был применен подход сиспользованием метода полногеномного секвенирования.
В качестве платформ длясеквенирования были выбраны приборы «GS Junior» фирмы «Roche» и «Ion Torrent» фирмы «LifeTechnologies». Фрагменты гена ACVR2A секвенировали с 30-ти кратным покрытием. Суммарно в65-ти образцах выявлено 246 нуклеотидных вариаций, половина из которых не представлена вбазах данных «1000 геномов» и «dbSNP135», а 135 имеют номер «rs». 25 замен представляютсобой делеции/инсерции и 221 – однонуклеотидные вариации (SNP).«Фильтрацию» данных секвенирования образцов ДНК проводили с использованием двухбиоинформатических подходов. Первый проведен с применением общедоступных интернетресурсов - «Gene-Talk» (http://www.gene-talk.de).
Ресурс позволяет «отфильтровывать» данные поразным критериям, одним из которых является научная и клиническая значимость выявленногогенетического маркера. Задачей данного этапа было выяснить, какие, и в каком количестве упациенток с гестозом встречаются клинически значимые варианты. После «фильтрации» данныхбыло установлено, что максимальной научной и медицинской значимостью, обладает 31 из 246обнаруженных вариантов. Наличие этих вариантов было подтверждено в «ручном режиме» спомощью программы «UGENE» (Okonechnikov et al., 2012). Клинически значимые вариантыобнаружены у каждой пациентки, при чем, у некоторых из них были выявлены несколько такихзамен одновременно. На это указывают достаточно высокая частота альтернативного варианта,которая в ряде случаях достигала 80-100% (например, для rs1424943).
Большое число вариантов вгене ACVR2A и их высокая представленность среди больных с гестозом не позволяетрассматривать данные варианты как «исключительные» маркеры этого заболевания (Глотов и др.,2014). Другой биоинформатический подход заключался в анализе функциональной значимостивыявленных замен для оценки их возможного влияния на функцию белка. Однако алгоритмыPolyPhen и SIFT (Wang et al., 2010; Chang et al., 2012), которые были использованы для решенияэтой задачи, не выявили ни одного маркера, значимо влияющего на активность фермента ACVR2A(Глотов и др., 2014).Следующий этап работы был направлен на поиск дополнительной доказательной базыотносительно группы ранее выявленных «значимых» вариантов в гене ACVR2A.
С этой целью былиспользован метод корреляции по Пирсону, позволяющий оценить влияние комбинаций аллелейпо «медицински значимым» вариантам гена ACVR2A на изменения таких диагностическизначимых параметров при гестозе как «САД», «ДАД» и «наличие белка в моче». Статистическизначимая корреляция была выявлена между rs1364657, rs7601098, rs3820716 гена ACVR2A ибелком в моче, а также между rs7601098 и диастолическим артериальным давлением (p<0,03)(Глотов и др., 2014). С помощью точного теста Фишера, была выявлена достоверная ассоциация20между вариантом rs3764955 тяжестью гестоза и образованием отеков (p<0,05). Необходимоотметить, что эти результаты противоречат данным аналогичного сравнения, выполненногоотечественными авторами (Ворожищева и др., 2013), но соответствует таковым в работенорвежских исследователей (Roten et al., 2009).Далее нами был проведен сравнительный анализ данных секвенирования гена ACVR2A вгруппе пациентов и в группе контроля, используя разработанный ранее алгоритм, которыйпозволяет применять две аддитивные модели (Glotov et al., 2015).
Одна из них, предполагает, чтоклинический эффект зависит от наличия альтернативной аллели («доминантная модель»), другая –от альтернативного генотипа («рецессивная модель»). В доминантной модели идентифицировано246 вариантов. Из них были отобраны главные маркеры, согласно следующим критериям:score>10 и/или p<0,01 и мутация «покрыта» более чем в 90% образцах (см. табл. 8). Семнадцатьвариантов, из которых только 6 имели свой rs номер (это варианты rs145399059, rs115418286,rs41468049, rs111430637, rs373204686, rs148618849), характеризовали наличие риска заболевания,а один вариант - протекцию против него (rs17742573).Таблица 8.ACVR2A-маркеры гестоза («доминантная модель»).СтартоваяпозицияИсходнаяпоследовательностьНуклеотидная заменаТипзамены148642724148606243148613074148609077148646876148652327148686453148643432148645421148651206148652167148654065148655053148657857148659844148680419148687457148643956TGGTGTTATTCAAGGGAATAACTCCCCGCCGGGAAAGGindelSNPSNPSNPSNPSNPSNPSNPSNPSNPSNPSNPSNPSNPSNPSNPSNPSNPНомер rs.rs145399059rs115418286rs41468049..rs111430637...rs373204686..rs148618849...rs17742573Болезнь/здоровьев%18/013/08/05/05/05/05/03/03/03/03/03/03/03/03/03/03/00/23ScoreScore27050302020202010101010101010101010-250-350-250-150-100-100-100-100-50-50-50-50-50-50-50-50-50-5050p-value(CC_DOMмодель, snpSift)0,02320,08710,20800,38110,38920,37780,38110,60710,62070,63930,64410,63160,63790,63790,62710,61400,63930,0069Таблица 9ACVR2A-маркеры гестоза («рецессивная модель»).Стартоваяпозиция148606243148606674148607210148687731ИсходнаяпоследовательностьGAGAНуклеотидная заменаCCTCТипзаменыНомер rsБолезнь/здоровьев%ScoreScore2p-value(CC_RECмодель, snpSift)SNPSNPSNPSNPrs145399059rs62169479rs62169480*rs176926483/03/03/03/010101010-50-50-50-500,62710,62710,62070,6333* - клинически значимый маркер согласно порталу «Gene-Talk».Необходимо отметить, что согласно SNPSIFT тесту (p<0,05), наиболее существеннымизаменами были инсерция insAA в позиции 148642724, связанная с риском болезни, и протективнаязамена A на G в позиции 148643956 (rs17742573).
Можно предполагать, что наличие инсерцииinsAA хотя бы на одной из хромосом стимулирует развитие гестоза, тогда как наличие варианта Gв rs17742573 – наоборот, оказывает протективный эффект. В рецессивной модели (табл. 9)идентифицировано 57 вариантов, из которых только четыре соответствовали выбраннымкритериям (см. выше).
Для замен rs145399059, rs62169479, rs62169480, rs17692648 показанаассоциация с заболеванием. Важно отметить, что вариант rs145399059 выявлен как маркер гестозав двух моделях, а вариант rs17692648 является клинически значимым маркером гестоза согласнопорталу «Gene-Talk». Эти результаты позволяют рассматривать варианты rs145399059 иrs17692648 как возможные маркеры риска развития гестоза.Сравнительный анализ уровня микроРНК в плаценте у больных гестозом и при нормальнойбеременности.
Для поиска и комплексного изучения маркеров гестоза на уровне транскриптомовиспользован метод полногеномного секвенирования. Были изучены спектр и уровень микроРНК вворсинчатом хорионе плаценты у рожениц с нормальной беременностью и с беременностью,осложненной различными формами гестоза. Всего секвенировано 14 библиотек кДНК. В21результате секвенирования получено 2241561, 2527969 и 1502484 «ридов» (просеквенированныхфрагментов ДНК), соответствующих контролю, гестозу (в целом) и гестозу, осложненномугипертонией, соответственно, выровненных на геном человека, со средней длиной «рида» от 19 до24 нуклеотидов. Необходимо отметить, что для всех трех групп образцов были выявлены около500 известных микроРНК с покрытием не менее 5 ридов.Дальнейшие эксперименты по сравнению спектров микроРНК, в ворсинчатом хорионеплаценты рожениц с гестозом в целом и с гестозом, осложненным гипертонией, в сравнении снормой, позволили выявить 13 микроРНК, достоверно отличающихся (p<0,01) экспрессией вобразцах плацент от женщин с гестозом по сравнению с контрольной группой (Vashukova et al.,2016).
Однако, с учетом поправки на множественные сравнения (FDR<0,05), таких микроРНКвыявлено не было (Vashukova et al., 2016).С другой стороны, гестоз на фоне гипертонической болезни характеризовало изменениеуровня 51 микроРНК (p<0,01), из которых 22 соответствовали поправке на множественныесравнения (FDR<0,05). 7-мь из них снижали уровень при гестозе: miR-135b-5p, miR-195-5p, let-7f5p, miR-34c-5p, miR-1-3p, miR-98-5p, miR-223-3p, а 15-ть – повышали: miR-515-3p, miR-31-5p,miR-210-3p, miR-518a-3p, miR-524-3p, miR-518c-3p, miR-520a-3p, miR-515-5p, miR-516a-5p, miR519e-5p, miR-193b-3p, miR-4532, miR-518f-3p, miR-518a-5p, miR-518e-3p (Vashukova et al., 2016).В нашем исследовании не было обнаружено специфических маркеров гестоза в целом, нобыли обнаружены маркеры гестоза на фоне сопутствующего заболевания – гипертонии, чтосвидетельствует в пользу предположения о том, что данная патология представляет собойсложный синдромокомплекс, молекулярно-генетические механизмы которого следуетрассматривать только с учетом клинических данных.Необходимо отметить, что некоторые из микроРНК, выявленные нами при гестозе на фонегипертонии, соответствуют ранее установленным маркерам данного заболевания другимиавторами (Zhu et al., 2009; Ishibashi et al., 2012; Chen et al., 2013).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
