Автореферат (1144819), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Для проведения секвенирования использовали«Ion 314™ Chip», «Ion 316™ Chip» или «Ion 318™ Chip» и наборы реагентов «Ion PGM™Sequencing 300 Kit» или «Ion PGM™ Sequencing 200 Kit» («Life technologies», США). Запускприбора планировали, внося соответствующие стартовые характеристики, на специальном ресурсе«Torrent Browser», согласно инструкции «Torrent Suite 3.4.1» («Life technologies», США). Анализполученных данных проводили путем выравнивания нуклеотидных последовательностей противреференсного генома HG 19LT, используя ресурс «Alignment v3.6.56201», и генерированиянеобходимых файлов форматов (*.fastq, *.bam и *.vcf) с помощью интернет-сервера «TorrentServer», согласно инструкции «Torrent Suite 3.4.1» («Life technologies», США).
Поискнуклеотидных замен осуществляли, используя стандартные установки ресурса «variant Callerv3.6.63335» этого же сервера, и, используя программу «UGENE» («Unipro», Россия).NGS секвенирование на приборе «GS Junior». Подготовку библиотек для секвенированияпроводили с помощью набора «GS Rapid Library Prep Kit» («Roche», Швейцария). Секвенированиеполученной библиотеки проводили с помощью набора «GS Junior Titanium Sequencing Kit»(«Roche», Швейцария) по стандартной процедуре.
Выравнивание полученных нуклеотидныхпоследовательностей с референсной последовательностью гена ACVR2A проводили с помощьюпрограммы «GS Reference Mapper» («Roche», Швейцария), генерируя файлы необходимогоформата (*.sff).Обработка данных NGS секвенирования. Аннотирование и «фильтрацию» вариантов проб ДНКпосле NGS секвенирования осуществляли с помощью известного ресурса wANNOVAR (Wang etal., 2010; Chang et al., 2012) и нового интернет-ресурса «Gene-Talk» (http://www.gene-talk.de).Статистические расчеты проводили, используя PLINK (Purcell et al., 2007) и SnpSift (Cingolani etal., 2012). Функциональную значимость выявленных замен проводили с помощью ресурсов10Polyphen2 (Kumar et al., 2009) и SIFT (Adzhubei et al., 2010). Анализ уровня микроРНК проводили,используя новый алгоритм CAP-miRSeq (Sun et al., 2014).
Анализ дифференциальной экспрессиигенов проводили с помощью пакета edgeR» (Robinson et al., 2010).Построение ассоциативных сетей. Для построения ассоциативных сетей использоваликомпьютерную систему «ANDSystem» (Demenkov et al, 2012) и «STRING» (Franceschini et al.,2013).Статистическая обработка данных. Сравнение количественных показателей выборок нанормальность проводили с помощью критерия Шапиро-Уилка. Сравнение выборок поколичественным показателям осуществляли с помощью U-критерия Манна-Уитни, коэффициенткорреляции вычисляли методом Спирмена, проверку соответствия распределения комбинацииаллелей ожидаемому рассчитывали методом 2, анализ межгенных взаимодействий проводили спомощью программы MDR (Ritchie et al., 2001), расчет показателя соотношения шансов,построение логистических регрессионных моделей, «ROC-кривых» проводили с применениемпакетов программ «GraphPad InStat» (США), «STATISTICA 12.0 (США) и в среде длястатистических вычислений «R» c помощью программы «R Cloud Workbench» (Goncalves et al.,2011).РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕРАЗРАБОТКА БИОЧИП-ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ АНАЛИЗА ГЕНЕТИЧЕСКОГОПОЛИМОРФИЗМА.Система свертывания крови – «Фибр-биочип».
Ранее нами был разработан алгоритм созданиябиочипов (Глотов и др., 2005). В рамках данного алгоритма были созданы «Фармакогенетическийбиочип» и «Кардио-чип». Для реализации цели настоящей работы был разработан еще одинтематический микрочип - «Фибр-биочип». При создании «Фибр-биочипа» были выбранывариабельные участки 6 генов: F5 (1691G>A), F2 (20210G>A), SERPINE1 или PAI1 (-675 5G>4G),FGB (455G>A), ITGB3 или GP3a (1565Т>С) и MTHFR (677C>Т), которые ассоциированы срегуляцией процессов коагуляции и имеют важное значение в развитии патологии беременности.Олигонуклеотидные пробы в составе биочипа сгруппированы в блоки. Блок №1 предназначен длявыявления полиморфизма по генам F5 (1691G>A), F2 (20210G>A), FGB (455G>A).
Блок №2предназначен для анализа полиморфизма в генах SERPINE1 (-675 5G>4G), ITGB3 или GP3a(1565Т>С) и MTHFR (677С>Т). Примеры гибридизаций на этом биочипе приведены на рис. 1.Рис. 1. Гибридизация на«Фибр-чипе» (Вашукова идр., 2008). Стрелками нарисунке и красным шрифтом вподписяхотмеченыобнаруженные«мутантные»варианты (овалом выделенытакие ячейки).Биочип протестирован на 100 контрольных и 300 клинических образцах. Результатытестирования контрольных образцов (идентификация мутаций в них проводили так же методамиПДРФ-анализа, секвенированием и другими) показали полное совпадение. Анализ клиническихобразцов выявил пять расхождений из 1800 проанализированных полиморфных вариантов.
Такимобразом, точность данного метода равна 99,9%. Чувствительность биочипа сопоставима с таковойу «Фармакогенетического биочипа» и «Кардиочипа» (Глотов и др. 2005, 2007), и составляет 10 нггеномной ДНК. Технология биочипов удобна для быстрого и точного определения(скринирования) несколько десятков замен. Разработанный нами блочный принципконструирования биочипа позволяет достаточно быстро адаптировать эту технологию длярешения практических задач. Блочный подход особенно предпочтителен для анализа генетическихмаркеров определенных метаболических путей (в случае «Фибр-биочипа» и «Кардиочипа»).Оценка преимуществ метода гибридизации на биочипах для изучения генетическогополиморфизма человека.
Несмотря на активное развитие в последние 5-10 лет технологииполногеномного секвенирования, масспектрометрии и других методов, гибридизация на биочипахнизкой плотности сохраняет большие перспективы, благодаря её низкой стоимости и возможностибыстрого, точного и одновременного анализа многих генов и мутаций (Gryadunov et al., 2011;Marasso et al., 2014). Разработанный нами «Фибр-биочип» предназначен, прежде всего, для11рутинной диагностики. Приоритетом «Фибр-биочипа» остается диагностика наследственнойтромбофилии, которая является риском развития ряда патологий, включая гестоз и тромбоз(Kupferminc, 2005; Vlachou et al., 2010).
Среди зарубежных аналогов можно выделить такиеразработки как трехсенсорная панель для детекции мутаций в генах тромбофилии (Vlachou et al.,2010), Verigene® F5/F2/MTHFR тест (Lefferts et al., 2009), и другие. Большинство этих разработокпока не внедрены в практику, тогда как «Фибр-биочипа» (торговая марка «ПФ-биочип» (Тромбо)уже широко используется в клинике. Только в ФГБНУ «НИИ АГиР им.Д.О.Отта» с помощьюмикрочиповой технологии в год проводят более 1500 анализов.Большинство современных биочипов являются SNP-микрочипами, с помощью которыхможно исследовать более миллиона однонуклеотидных замен одновременно.
Такие биочипыдороги, однако их можно использовать в микроделеционном анализе (Riggs et al., 2014), висследованиях типа GWAS (Smith et al., 2010; Tang et al., 2013), а также при диагностикенекоторых наследственных заболеваний и МФЗ (Moutereau et al., 2004; Theodoraki et al., 2010).Несмотря на преимущества биочипов «высокой плотности», сегодня они быстро замещаютсятехнологией секвенирования следующего поколения (NGS). NGS является наиболеевысокопродуктивной технологией исследования генома (Ong et al., 2013). Однако и она не лишенаряда недостатков, главным из которых является высокая частота так называемых «indel error rate»- ошибок при детекции инсерций и делеций (Robasky et al., 2014). На примере анализаполиморфизма в генах SERPINE1 (PAI1), rs1799762 (5G>4G) и MTHFR (C/T, rs1801133) былопроведено сравнение метода биочипов и NGS секвенирования (Glotov et al., 2016).
Установлено,что обе технологии с высокой точностью определяют генотипы по гену MTHFR (C/T, rs1801133),однако при детекции 5G>4G замены по гену SERPINE1 (вариант «инсерция/делеция») возникаюттрудности. Определять данный вариант способен только метод биочипов, тогда как при NGSсеквенировании он регистрируется исключительно только как 4G/4G. Такая особенностьобъясняется плохой детекцией технологией полупроводникового секвенирования гомополимеровнуклеотидов (Robasky et al., 2014). А так как подобных замен в геноме человека немало (Robaskyet al., 2014), развитие альтернативных NGS секвенированию методов генетической диагностикиостается одной их приоритетных задач биомедицины.Таким образом, ни одна из существующих технологий анализа ДНК не являетсяуниверсальной, ее выбор во многом определяется задачами исследования.
При необходимостирутинной диагностики, нацеленной на анализ ограниченного числа полиморфных сайтов,технология биочипов остается вполне востребованной и сегодня.ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ И ПОИСК НОВЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХМАРКЕРОВ РИСКА ГЕСТОЗА, АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ И ОЖИРЕНИЯ СМЕТАБОЛИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ.Несмотря на длительную историю исследования патогенеза гестоза, артериальнойгипертензии и ожирения с метаболическим синдромом, вклад наследственного компонента в ихвозникновение и развитие не выяснен. В настоящей работе проведено исследование аллелейотдельных генов-кандидатов данных болезней с использованием двух микрочипов - «Кардиочипа»и «Фибр-биочипа», с помощью ПЦР/ПДРФ анализа, а также метода секвенирования следующегопоколения. Были изучены особенности распределения частот аллелей и их комбинации для болеедвадцати генов, регулирующих четыре важнейшие функции организма: АД, свертываемостькрови, функцию эндотелия и липидный обмен, а также проведен углубленный анализ вкладаотдельных генов и генных систем в патогенез заболеваний.
Кроме того, методом NGS проведено«целевое» секвенирование нуклеотидной последовательности гена-кандидата МФЗ, изученуровень микроРНК и роль некоторых эпигенетических маркеров в патогенезе МФЗ, показаныперспективы исследований с помощью ассоциативных сетей.Наследственные маркеры гестоза.Сравнительный анализ частот аллелей и их комбинаций. С помощью биочипов: «Кардиобиочип» (Глотов и др., 2007), «Фибр-биочип» и методом ПЦР-ПДРФ изучены полиморфные сайтыследующих 16-ти генов: REN (-83G>A), AGT (M235T), AGTR1 (1166A>C), AGTR2 (3123C>A),BDKRB2 (-58T>C), ADRB2 (48A>G, 81C>G), MTHFR (677C>T), F5 (1691G>A), ITGB3 (196C>T),SERPINE1 (5G>4G), FGB (455G>A), F2 (20210G>A), APOE (E2, E3,E4), LPL (Ser447Stop), NOS3 (786T>C), ACE (I/D).
Сравнительный анализ частот аллелей и их комбинаций для генов APOE,REN, AGT, AGTR1, BDKRB2, NOS3, LPL, F5, ITGB3, FGB не выявил статистически значимыхразличий между группой женщин с патологией беременности (гестоз) и женщинами с12физиологической беременностью (см. табл. 1). Однако такие различия были выявлены покомбинациям аллелей четырех генов: AGTR2, MTHFR, SERPINE1, F2 (см. табл. 1).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
