Автореферат (1144819), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Н.И. Вавилова, 2006, Москва; 3-rd International Conference «Genomix,Proteomics, Bioinformatics and Nanotechnologies for Medicine», 2006, Novosibirsk, Russia;всероссийской конференции «Перспективы фундаментальной геронтологии, 2006, СанктПетербург; VI European Congress «International Association of Gerontology and Geriatrics», 2007,Saint-Petersburg, Russia; Conference for Yong Scientist, PhD Students and Students on molecularbiology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M.I.Vavilov, 2007, Kyiv, Ukraine; Донозология– 2007, 2007, Санкт-Петербург; XX International Congress of Genetics, 2008, Berlin, Germany;международном форуме по НАНОТЕХНОЛОГИЯМ Rusnanotech 08, 2008, Москва;международном форуме по нанотехнологиям, 2009, Москва; девятом российском конгрессе«Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии», 2010, Москва; SysPatho Workshop«Systems Biology and Medicine», 2012, Tsarskoe Selo, Saint-Petersburg, Russia; II всероссийскойнаучной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьеготысячелетия», 2012, Санкт-Петербург.Представленные в диссертации результаты связаны с научно-исследовательскими работамипо персональным грантам Правительства Санкт-Петербурга (2007, 2009, 2011, 2012, 2013), грантуBRHE Fellowship competition 2006, грантам Президента Российской Федерации (2008, 2012),грантом Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадрыинновационной России» на 2009-2013 гг., в рамках реализации мероприятия № 1.2.2 Проведениенаучных исследований научными группами под руководством кандидатов наук (2009-2011), атакже по грантам на проведение исследований: ГК Федерального агентства по науке и инновациям(I-04).
«Развитие и массовое применение новых технологий диагностики социально-значимыхзаболеваний на основе молекулярных методов многопараметрического анализа», 2004-2007; ГКФедерального агентства по науке и инновациям № 02.512.11.2275: «Работы по проведениюпроблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела вобласти живых систем с участием научных организаций Украины» (шифр заявки «2009-02-1.2-0001-002»), 2009-2010; РФФИ, 09-04-13849-офи_ц «Разработка новых методических иметодологических подходов к анализу генов системы свертывания крови и фибринолиза - важныхпатогенетических факторов риска детского и материнского здоровья»; ГК Министерства науки иобразования РФ № 02.740.11.0698 «Проведение научных исследований коллективами научнообразовательных центров в области общей биологии и генетики» шифр «2010-1.1-141-042» потеме: «Роль организации и экспрессии генетического материала в наследственной иненаследственной изменчивости» и тема СПбГУ в рамках мероприятия 2 - «Проведениефундаментальных научных исследований по областям знаний, обеспечивающим подготовкукадров в СПбГУ», шифр ИАС 1.38.79.2012 «Исследование молекулярно-генетическихдетерминант здоровья студентов, занимающихся физической культурой и спортом в СПбГУ».Внедрение результатов исследования в практику.
Результаты исследования внедрены впрактику лечебной и учебной работы ФГБНУ «НИИ АГиР им.Д.О.Отта», СПбГУ, ИМБ РАН,ФГАУ «Научный центр здоровья детей» МЗРФ.Публикации. По материалам диссертации опубликовано 69 печатных работ, в том числе 17 статейв изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, 4 статьи – ввысокорейтинговых зарубежных рецензируемых журналах, индексируемых в Scopus и WoS, 4статьи в прочих изданиях и 3 патента.Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 417 страницах машинописноготекста, содержит 76 таблиц, иллюстрирована 40 рисунками и состоит из следующих разделов:введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и8обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 470научных источников (94 – на русском языке и 346 – на иностранном) и 30 интернет-источников.Личный вклад автора в проведенное исследование.
Автором лично предложена основная идеяисследования, определены цель и задачи. Все результаты экспериментального исследования,составившие основное содержание работы, получены автором лично или при егонепосредственном участии. Статистическая обработка и интерпретация полученных результатов,сопоставление с данными, полученными отечественными и зарубежными учеными, формулировкатеоретических выводов и подготовка материалов диссертационного исследования к публикациипроведены соискателем лично.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫХарактеристика исследуемых групп. Исследование проводили на образцах биологическогоматериала, полученных от 1104 индивидуумов, в том числе от женщин с патологией беременности(гестоз) и без таковой (всего 250 человек), на образцах ДНК доноров - 228 человек, детейшкольников популяционной группы - 294 человека, детей с артериальной гипертензией (АГ) – 170человек и детей с ожирением и метаболическим синдромом (МСО) – 162 человека.Диагноз гестоз устанавливали при наличии не менее двух клинических проявлений вследующих сочетаниях: повышение артериального давления (АД) и отеки, отеки и протеинурия,сопровождающаяся повышением АД, а также классической триады симптомов - отеки,гипертензия, протеинурия (Айламазян, Мозговая, 2008).
Диагноз артериальная гипертензияставился в тех случаях, когда при казуальных измерениях артериального давления (АД) у ребенканеоднократно (не менее 3-х раз при отдельных визитах к врачу) отмечался повышенный уровеньАД (Образцова и др., 2005). Основную группу детей с МСО составили 162 человека с ожирениеми повышенным уровнем АД.
Из обследуемой группы были исключены дети с вторичныможирением, гипоталамическим синдромом пубертатно-юношеского периода, врожденнымипороками развития органов и систем. Рассчитывали процент избытка массы тела по стандартнымперцентильным таблицам и определяли степень ожирения по номограммам (Дедов, Петеркова,2006;). Измеряли уровень АД; повышенным считали уровень АД>90 перцентиля для данноговозраста, пола и роста (Миняйлова, 2009).Анализ эпигенетических маркеров был проведен на биологических образцах, полученных от17 женщин, родоразрешенных при доношенных сроках беременности путем операции кесаревасечения. Девять женщин имели физиологически нормальную беременность (контрольная группа)и восемь – беременность, осложненную тяжелым гестозом.
Из этих же групп были отобраныобразцы для исследования уровня микроРНК.От всех лиц, участвовавших в исследовании, было получено информированное согласие.Экстракция геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови, клеток буккальногоэпителия и ворсин плаценты. Выделение ДНК проводили в соответствии с методикой,приведенной в руководстве Сэмбрука (Sambrook et al., 1989), с некоторыми модификациями.Обработка ДНК бисульфитом натрия. Для бисульфитной обработки геномной ДНКиспользовали набор реагентов «EpiTect Bisulfite Kit» («Qiagen», США). Все процедуры проводилив соответствии с инструкцией фирмы-производителя.Экстракция микроРНК.
Для создания коллекции образцов микроРНК из плаценты использовалинабор реагентов «PureLink miRNA Isolation Kit» («Life technologies», США).Обратная транскрипция и получение кДНК. Для создания коллекции образцов кДНКиспользовали набор реагентов «Ion Total RNA-Seq2 Kit», рекомендованный «Life technologies»(США) для приготовления библиотек с целью последующего полногеномного секвенирования.Выбор праймеров. Нуклеотидные последовательности искомых фрагментов генов получали изинтернет-базы «Nucleotide» и «Ensembl» («NCBI», США и Европейский союз, соответственно).Праймеры, необходимые для амплификации этих фрагментов, подбирали с использованиемпрограммы «Oligo 6» (США).
Специфичность праймеров проверяли в программе «Nucleotidenucleotide BLAST» («NCBI», США).Амплификация фрагментов ДНК. Методом полимеразной цепной реакции исследовалиполиморфизм гена: ACE. Методом ПЦР с последующим ПДРФ-анализом исследовали аллельныеварианты генов: APOE, LPL, PTGIS, CYP2J2, CYP4A11, СDH13, MTHFR, CDKN2/BAS имежгенного маркера rs11191548.9Обработка эндонуклеазами рестрикции. Исследование аллельных вариантов генов APOE, LPL,PTGIS, CYP2J2, CYP4A11, СDH13, MTHFR, CDKN2/BAS и маркера rs11191548 проводили путемобработки эндонуклеазами рестрикции продуктов амплификации соответствующих генов.Визуализация ПЦР продуктов.
Наличие продуктов амплификации фрагментов генов, а такжеполноту их гидролиза оценивали по результатам электрофореза в 6% полиакриламидном геле.Синтез олигонуклеотидов и изготовление микрочипов. Олигонуклеотиды для иммобилизациина микрочипе синтезировали на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer («AppliedBiosystems», США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. Микроматрицабыла приготовлена путем фотополимеризации пористого полиакриламидного геля. Объем каждойкапли был равен примерно 0,2 нл.Амплификация фрагментов ДНК для анализа методом гибридизации на олигонуклеотидномбиочипе.
При проведении ПЦР фрагментов ДНК для анализа методом гибридизации наолигонуклеотидном биочипе гены объединяли в группы, соответствующие блокамолигонуклеотидных проб на биочипе. Продукт первого этапа ПЦР (1 мкл) использовали в качествематрицы на втором этапе ПЦР.Гибридизация меченого продукта на микрочипе. Гибридизацию на микрочипах проводили сиспользованием флуоресцентно меченых образцов, полученных на второй стадии мультиплекснойПЦР.Регистрация изображения и его обработка. Флуоресцентный сигнал от ячеек микрочипарегистрировали с помощью портативного анализатора биочипов «Чипдетектор-01-«БЧ-ИМБ».Анализ метилирования остатков цитозина в ДНК.
Анализ метилирования остатков цитозинапромоторного региона гена H19 в образцах ДНК плаценты проводили с помощьюметилчувствительной или метилспецифичной ПЦР, а также комбинированным бисульфитнорестрикционным анализом, используя набор реагентов «EpiTect Bisulfite Kit» («Qiagen», США).Создание ДНК-библиотек протяженных фрагментов ДНК методом «удлиняющей» ПЦР.Создание ДНК-библиотек проводили в два этапа. На первом этапе проводили амплификациюпоследовательности гена ACVR2A длиной в 89060 п.о.
Праймеры, необходимые для амплификациифрагментов от 2,5 до 9 тыс. п.о. подбирали на основании рекомендаций производителя«удлиняющей» полимеразы («Roche», Швейцария) и данных литературы (Knierim et al., 2011;Hernan et al., 2012). На второй стадии подготавливали библиотеки для секвенирования, согласноинструкции «Ion Xpress™ Plus Fragment Library Kit» к одноименному набору («Life technologies»,США).Создание библиотек микроРНК. Библиотеки микроРНК приготавливали в соответствии синструкцией к набору «Ion Total RNA-Seq Kit v2» («Life technologies», США).NGS секвенирование на приборе «Ion Torrent».
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
