Диссертация (1144759), страница 14
Текст из файла (страница 14)
В контрольных мышцах никотинвызывал гиперполяризацию только внесинаптического района мембраны, впостсинаптическом районе величина МПП не изменялась (рис. 3.16). Причинаэтого феномена обсуждалась нами выше (см. п. 3.2.2, рис. 3.7). Важно, что вмышцах мышей mdx никотин вообще не влиял на величины МПП обоих районовсарколеммы(рис.3.16),чтоможетсвидетельствоватьонарушениифункционального взаимодействия нХР и α2-изоформы Na,K-АТФазы.Еще один факт, косвенно свидельствующий о роли дистрофина ворганизациивзаимодействия этих белков – наличие высокодостовернойкорреляционной зависимости между интенсивностью флуоресцентных сигналовот 2-изоформы Na,K-АТФазы и нХР (R = 0.41; р < 0.0001) в постсинаптическом79районе мембраны мышей C57BL/6 (рис. 3.17, А).
У мышей mdx такая зависимостьотсутствовала (R = 0.04; р = 0.77) (рис. 3.17, Б).А140C57Bl/6a2 NKA , у.е.1201008060402000Б5010015020070a2 NKA , у.е.60mdx504030201000Рис.3.17.20406080100Флуоресценция нХР, у.е.Корреляционнаязависимостьмежду120интенсивностьюфлуоресцентных сигналов от 2-изоформы Na,K-АТФазы (мечение Вodipyconjugated ouabain) и нХР (мечение -бунгаротоксином) в постсинаптическомрайоне мембраны мышей C57BL/6 (106 концевых пластинок, 17 мышц, 10мышей) (А) и мышей mdx (72 концевые пластинки, 11 мышц, 6 мышей) (Б).80Таким образом, полученные нами данные позволяют предположить, чтодистрофин является необходимым молекулярным компонентом для реализациифункционального взаимодействия между нХР и 2-изоформой Na,K-АТФазы иподдержания локальной гиперполяризации мембраны концевой пластинки.3.2.4. Функциональное взаимодействие 2-изоформы Na,K-АТФазы ихолестеринаУчитывая роль холестерина в компартментализации, стабилизации ирегуляции Na,K-АТФазы (Chen et al., 2011; Haviv et al., 2013; Cornelius et al.,2015),можнопредположитьучастиехолестеринавформированиифункциональной связи между нХР и 2-изоформой Na,K-АТФазы, в том числе вкачестве молекулярного компонента этого комплекса.
Известно также, что нетолько холестерин участвует в регуляции Na,K-АТФазы, но и сама Na,K-АТФазаможет влиять на формирование кавеол, синтез холестерина и его траффик. Этопоказано для 1-изоформы Na,K-АТФазы (Chen et al., 2009; 2011). В отношении2-изоформы Na,K-АТФазы подобных данных нет.Чтобы понять, может ли сама активность 2-изоформы влиять настабильность липидных плотиков, нами были проведены опыты с применениемуабаина в концентрации 1 мкМ, что селективно блокирует 2-изоформу Na,KАТФазы (Krivoi et al., 2003; Heiny et al., 2010). В качестве маркера липидныхплотиков (рафтов) мы применяли субъединицу В холерного токсина (CTхB),снабженную флуоресцентной меткой (Fujinaga et al., 2003).
В камбаловидноймышце крысы оба сигнала от меченого -BTX (красный канал, нХР) и CTхB(зеленый канал, липидные плотики) были локализованы в области концевойпластинки и совпадали при наложении (рис. 3.18 А). Флуоресценция CTхB впостсинаптическом районе сарколеммы в 4 раза превышала таковую вовнесинаптическом районе (рис.
3.18 Б), что свидетельствует о концентрациилипид-упорядоченной фазы мембраны в зоне концевой пластинки.81В течение 15 мин действия 1 мкМ уабаина уровень флуоресценции СТхВснижался в постсинаптическом и внесинаптическом районах мембраны на ~30% ина ~20%, что указывает на снижение стабильности липидных плотиков приингибировании активности 2-изоформы Na,K-АТФазы (рис. 3.18 В). Эффектуабаина был полностью обратимым после 15 мин отмывания нормальнымфизиологическим раствором с последующим повторным окрашиванием СТхВ(рис. 3.18 Г).Рис.
3.18. Опыты с ингибированием 2-изоформы Na,K-АТФазы уабаином (1мкМ) и применением МЦД (0.1 мМ) для снижения уровня мембранногохолестерина. А – Распределение никотиновых холинорецепторов, меченых -ВТХ(красный канал), и липидных плотиков, определяемое по флуоресценции СТхВ(зеленый канал), в концевых пластинках камбаловидной мышцы крысы. Верхнийряд – до добавления в раствор уабаина (0 мин); нижний ряд – через 15 миндействияуабаина.Масштаб:10мкм.Б–ФлуоресценцияСТхВвпостсинаптическом (1) и внесинаптическом (2) районах мембраны. В – Динамика82флуоресценции СТхВ в течение 15 мин действия уабаина (начало действияотмечено стрелкой) по отношению к начальному уровню, принятому за 1.0.
Г и Д– Усредненные флуоресценции СТхВ в постсинаптическом районе мембранычерез 15 мин действия уабаина (Г) или МЦД (Д), через 15 мин отмываниянормальным физиологическим раствором и после повторного окрашивания СТхВ.На Д справа – отмывание физиологическим раствором с добавлением комплексаМЦД/холестерин. *p < 0.05 и **p < 0.01 по сравнению с соответствующимконтролем.
Количество крыс – 6, мышц – 8.Для изучения роли холестерина в наблюдаемых эффектах мы использовалиметил--циклодекстрин(МЦД),применяемыйдляманипулированияхолестерином и частичного удаления его из плазматической мембраны(Zidovetzki, Levitan, 2007). Через 15 мин действия 0.1 мМ МЦД наблюдалосьаналогичное снижение уровня флуоресценции СТхВ (стабильности липидныхплотиков) в постсинаптическом районе мембраны, как и при ингибировании 2изоформы Na,K-АТФазы.
Этот эффект сохранялся и после 15 мин отмываниянормальным физиологическим раствором с повторным окрашиванием СТхВ, чтосвидетельствует о более устойчивом характере вызванного МЦД разрушениялипидных плотиков по сравнению с уабаином (рис. 3.18 Д).Для встраивания в мембрану экзогенного холестерина мы применялидобавление в раствор комплекса МЦД/холестерин (Zidovetzki, Levitan, 2007).Само по себе добавление этого комплекса (5 мМ) не влияло на уровеньфлуоресценции СТхВ, однако после повторного окрашивания СТхВ наблюдалосьвосстановление флуоресценции до исходного уровня (рис. 3.18 Д). Посколькуповторное окрашивание маркирует вновь образованные липидные плотики,увеличение уровня флуоресценции свидетельствует о восстановлении ихструктуры.
То есть путем встраивания экзогенного холестерина можновосстановить липидные плотики, разрушенные 0.1 мМ МЦД.83Чтобы оценить роль холестерина в поддержании электрогенеза мышечноймембраны, мы в диафрагме крысы частично удаляли мембранный холестерин спомощью МβЦД и регистрировали изменение МПП. В течение 1 ч действияMβЦД в концентрации 0.1 мМ величина МПП во внесинаптическом районемембраны не изменялась. В то же время в постсинаптическом районе MβЦД ужечерез 15 мин действия полностью устранял локальную гиперполяризацию этогорайона мембраны, далее величины МПП обоих районов сарколеммы достоверноне различались (рис. 3.19 А). Локальная гиперполяризация не восстанавливалась ив течение 1 ч отмывания нормальным физиологическим раствором (не показано).Рис. 3.19.
Влияние частичного удаления мембранного холестерина спомощью 0.1 мМ МβЦД на мышечной электрогенез в диафрагме крысы впостсинаптическом (1) и внесинаптическом (2) районах мембраны. А – ИзменениеМПП в течение 1 ч действия МβЦД (отмечено горизонтальной полоской).ВертикальнойстрелкойпостсинаптическогорайонапоказанамембранылокальнаяпередгиперполяризациядобавлениемМβЦД.Б–Электрогенная активность 1- (темные столбцы) и 2- (светлые столбцы)изоформ Na,K-АТФазы.
**p < 0.01 по сравнению с соответствующим контролем.84Для определения электрогенной активности 2- и 1-изоформ Na,K-АТФазымы применили физиологический тест с использованием уабаина в концентрациях1 мкМ и 500 мкМ (см. п. 3.2.1, рис. 3.3, и Методику). Наш анализ показал, чтоМЦД (0.1 мМ) устраняет локальную гиперполяризацию постсинаптическоймембраны за счет селективного снижения электрогенной активности 2изоформы Na,K-АТФазы по всей сарколемме, причем эффект наиболее выражен впостсинаптическом районе мембраны (рис. 3.19 Б).В опытах с постоянным присутствием 1 мкМ уабаина само по себедобавление комплекса МЦД/холестерин не влияло на уровень флуоресценцииСТхВ в постсинаптическом районе мембраны.
Однако после повторногоокрашивания СТхВ наблюдалось полное восстановление флуоресценции СТхВ доисходного уровня (рис. 3.20 А, Б). Аналогичное, хотя и менее выраженное,восстановление наблюдалось и во внесинаптическом районе мембраны. Этифактысвидетельствуютовозможностипутемвстраиванияэкзогенногохолестерина восстанавливать липидные плотики, разрушенные блокированием2-изоформы Na,K-АТФазы даже в присутствии уабаина.Рис. 3.20. Применение комплекса МЦД/холестерин для восстановлениялипидных плотиков в постсинаптическом районе сарколеммы камбаловидной85мышцы крысы при блокировании 2-изоформы Na,K-АТФазы уабаином (1 мкМ).А–Примерыокрашиваниялипидныхплотиков,определяемогопофлуоресценции СТхВ (зеленый канал).
Масштаб: 10 мкм. Б – усредненнаяфлуоресценция СТхВ. На А и Б показаны изображения и флуоресценция посленачального окрашивания СТхВ (СТхВ), через 15 мин действия уабаина (Oua);через15минпоследобавления5мМкомплексаМЦД/холестерин(Oua+МЦД/хол) и после повторного окрашивания СТхВ (Oua+CTxB). * р ˂ 0.05по сравнению с соответствующим исходным уровнем СТхВ флуоресценции.В целом полученные результаты позволяют предположить, что в скелетноймышце крысы существует реципрокное взаимодействие между 2-изоформойNa,K-АТФазы и холестерином, которое служит физиологическим механизмомподдержания мышечного электрогенеза и наиболее функционально значимо вобласти концевой пластинки.
Холестерин, как и дистрофин, является возможнымфактороммолекулярногоокружения,играющимрольвформированиифункционального комплекса нХР/2-изоформа Na,K-АТФазы.3.3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВЛокализация и функциональная специализация 1- и 2-изоформ Na,KАТФазы в скелетной мышце в течение многих лет является предметом дельногоизучения (обзоры: Кривой, 2012; 2014; 2016; McDonough et al., 2002; Clausen,2013; Matchkov, Krivoi, 2016; Pirkmajer, Chibalin, 2016; Kutz et al., 2018). Вскелетных мышцах 2-изоформа доминирует и её количество составляет от 60%до 87% от общего количества Na,K-АТФазы в зависимости от типа мышечныхволокон (Orlowski, Lingrel, 1988; He et al., 2001). Многочисленные данныесвидетельствуют о различии функций 1- и 2-изоформ в скелетной мышце и осущественной неоднородности их распределения в сарколемме.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
