Диссертация (1144759), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Если 1-86изоформа относительно равномерно распределена в плазматической мембране, то2-изоформа преимущественно локализована в Т-системе; ее кавеолярнаяфракция невелика и достигает 17% от ее общего количества (Williams et al., 2001;Cougnon et al., 2002; Kristensen et al., 2008; Kristensen, Juel, 2010).В связи с последним важно отметить, что данные по ко-иммунопреципитациинХР, Na,K-АТФазы, фосфолеммана (белок FXYD1) и кавеолина-3 (маркер кавеол вмышечных клетках) позволяют предположить, что эти белки образуютмультимолекулярный комплекс, локализованный в кавеолах (Heiny et al., 2010;Chibalin et al., 2012; Matchkov, Krivoi, 2016).
Другие экспериментальные данныепозволили предсказать, что с нХР функционально связано только ~25% пула 2изоформы Na,K-АТФазы (Krivoi et al., 2006).По ряду данных, 1-изоформа Na,K-АТФазы осуществляет базовуюфункцию поддержания ионныхградиентов,мышечногоэлектрогенеза исократительной функции (He et al., 2001; Krivoi et al., 2003; Radzyukevich et al.,2004), тогда как 2-изоформа осуществляет скорее регуляторные функции (Krivoiet al., 2006; Radzyukevich et al., 2009; 2013; Heiny et al., 2010; DiFranco et al., 2015).Роль различных пулов 2-изоформы Na,K-АТФазы в этих специализированныхфункциях изучена недостаточно.Исследование локализованнной в Т-системе 2-изоформы показало, что этотпул энзима малоактивен в покое и при слабой двигательной нагрузке.
Но этот пул2-изоформы играет важную роль в поддержании работоспособности скелетноймышцы при интенсивной нагрузке в условиях существенного накопления ионовкалия в узких пространствах Т-системы с ограниченной диффузией. Такаяфункциональная специализация обусловлена относительно низкой аффинностью2-изоформы к калию по сравнения с 1-изоформой. Поэтому 1-изоформавыполняет основную насосную функцию в покое и при слабой сократительнойактивности, 2-изоформа в таких условиях малоактивна. Однако ее активностьбыстро повышается при интенсивной мышечной работе, сопровождающейсянакоплением калия в Т-системе (Radzyukevich et al., 2013; DiFranco et al., 2015).87Нами показано, что особенностью распределения 2-изоформы Na,KАТФазы в сарколемме является локализация одного из её пулов в областиконцевой пластинки, то есть области наиболее плотного распределения нХР. Этотпул 2-изофоры за счет функционального взаимодействия с нХР участвует вспециализированном физиологическом механизме поддержания мышечногоэлектрогенеза (локальная гиперполяризация постсинаптической мембраны).
Нашепредположение о функциональном взаимодействии между нХР и 2-изоформойбазируется на данных о прямом молекулярном взаимодействии этих белков(Krivoi et al., 2006; Heiny et al., 2010; Matchkov, Krivoi, 2016). Проведенный намианализ не подтвердил ионную природу этого взаимодействия и позволилпредположить, что наиболее вероятным для его осуществления являетсяконформационный переход нХР в состояние десенситизации.Ранее нами было установлено, что величина ЭК50 для вызываемой АХгиперполяризации составляет около 30 нМ (c и др., 2004; Krivoi et al., 2006), чтонамного меньше констант активации нХР скелетной мышцы (десятки мкМ) (Peperet al., 1982; Garland et al., 1998). Это свидетельствует об участии вгиперполяризующем эффекте АХ рецепторов, характеризующихся повышеннойаффинностью к АХ.
В соответствии с общепринятыми моделями нХР существуетв трех основных конформационных состояниях: закрытом, открытом инепроводящем десенситизированном. Установлено, что АХ способен связыватьсяс нХР в десенситизированном состоянии, при котором аффинность рецептора кАХ повышена на 2 – 4 порядка и лежит в наномолярном диапазоне (Prince, Sine,1999; Wilson, Karlin, 2001; Mourot et al., 2006), сопоставимом с уровнемнегидролизованного АХ в синаптической щели.
Наши данные показывают, чтомодулирующим Na,K-AТФазу сигналом может быть конформационный переходнХР в состояние десенситизации, причем неважно чем этот переход вызван –длительнымдействиемфармакологическими агентами.наномолярныхконцентрацийАХили88Представляется важным выяснение роли других факторов молекулярногоокружения в формировании и функционировании комплекса нХР/2-изоформаNa,K-АТФазы. Результаты наших опытов позволяют предположить, что одним изтаких факторов может быть белок цитоскелета дистрофин, участвующий ворганизации постсинаптического скаффолда и кластеризации нХР.
Этот вопростребует дальнейшего изучения.На функционирование Na,K-АТФазы существенное влияние оказывает такжелипидное окружение, в частности, холестерин (Chen et al., 2011; Haviv et al., 2013;Cornelius et al., 2015; Habeck et al., 2015). Продемонстрирована относительноменьшаястабильность2-изоформывплазматическоймембране,чтообусловлено особенностями ее трансмембранных доменов М8, М9 и М10,отвечающих за взаимодействие с фосфолипидами, а также более слабойассоциацией с белком FXYD1 (Lifshitz et al., 2007; Kapri-Pardes et al., 2011).Однако эти данные получены с использованием дрожжей Pichia pastoris вкачестве экспрессионной системы.Нами впервые показано, что в скелетной мышце крысы существуетреципрокноевзаимодействиехолестерином,который,междувозможно,2-изоформойявляетсяещеNa,K-АТФазыоднимимолекулярнымкомпонентом, необходимым для поддержания механизма функциональной связинХР и α2-изоформы.
По некоторым данным, наиболее вероятным с точки зрениявзаимодействия Na,K-АТФазы с холестерином является её конформационноесостояние E2 (Habeck et al., 2015), однако здесь требуется дальнейшийспециальный анализ.89ГЛАВА 4. ХРОНИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ НИКОТИНА В СКЕЛЕТНОЙМЫШЦЕ4.1. ВВЕДЕНИЕ4.1.1. Общие сведения о никотиновом холинорецептореНикотиновый холинорецептор (нХР) – первый синаптический рецептор,который был выделен, очищен и подробно исследован на молекулярном уровне.Эти рецепторы принадлежат к суперсемейству лиганд-управляемых ионныхканалов. К этому семейству относятся также рецепторы ГАМКA, ГАМКC,глицина, серотонина типа 5-HT3, рецепторы глутамата у беспозвоночных (Скок идр., 1987; McGehee, Role, 1995; Paterson, Nordberg, 2000; Grutter, Changeux, 2001;Dani, 2015).
В ЦНС эти рецепторы участвуют во многих физиологических иповеденческихфункциях(когнитивныепроцессы,памятьиобучение,нейрональное развитие, мозговой кровоток и метаболизм, формированиеникотиновой зависимости и др.) (McGehee, Role, 1995; Jones et al., 1999; Paterson,Nordberg, 2000; Grutter, Changeux, 2001; Albuquerque, 2009).
В скелетной мышценХР опосредуют синаптическую передачу сигнала от двигательного нерва кмышце.В зрелой скелетной мышце млекопитающих нХР представляет собойкомплекс, состоящий из 5 гомологичных (рис. 4.1), но функционально различных,кодируемых разными генами субъединиц: α, β, ε и δ (стехиометрическая формула(α)2βεδ (Sanes, Lichtman, 1999; Sine, 2012). Субъединица экспрессируется тольков электрическом органе ската и в эмбриональной скелетной мышце, в зреломрецепторе активируется транскрипция гена субъединицы ε.
Все субъединицы нХРкодируются родственными генами, они обладают многими общими чертами.Каждая субъединица представляет собой интегральный белок, четыреждыпересекающий мембрану и формирующий трансмембранные сегменты М1 – М4.N- и С-концевой домены располагаются вне клетки, имеют обширную90цитоплазматическую петлю (соединяющую трансмембранные сегменты М3 и М4)с уникальной последовательностью для каждого типа субъединицы. Рецепторимеет вид псевдосимметричной розетки с каналом, расположенным нацентральной оси, молекулярная масса этого комплекса составляет примерно 240кДа (Paterson, Nordberg, 2000Corringer et al., 2000; Grutter, Chandeux, 2001;Benjamin et al., 2006; Karczmar, 2007; daCosta, Baenziger, 2009).Рис. 4.1.
Схематическое изображение никотинового холинорецептора влипидном бислое. 1 – сайты связывания агонистов (ацетилхолин, никотин икарбахолин)иантагонистовконкурентноготипа(d-тубокурарин,-бунгаротоксин); 2 – место связывания антагонистов неконкурентного типа(проадифен, прокаин и гистрионикотоксин).На нХР находятся два сайта связывания с ацетилхолином (АХ) (рис. 4.1),которые находятся в локусах, образуемых парами субъединиц αε () и . Такаякомбинация субъединиц дает возможность двум локусам одного рецептораобладать разными характеристиками связывания агонистов (Prince, Sine, 1999;Millar, Gotti, 2009; Sine, 2012).Расшифровка трехмерной структуры нХР показала, что сайты связыванияАХ и ионный канал образованы разными доменами, которые находятся на91значительном расстоянии друг от друга (2 – 4 нм).
Взаимодействие между этимидоменами, которое обеспечивает открывание канала после связывания агониста,является аллостерическим (Changeux, Edelstein, 2001; Sine, 2012). Связываниеагониста вызывает конформационные изменения рецептора и дальнейшееоткрываниенеселективногокатионногоканала,проводимостькоторогосоставляет 20 – 30 pS.
Через открывшийся канал по электрохимическомуградиенту в клетку входят ионы натрия и лишь в небольшой степени кальция, аионы калия движутся в противоположном направлении (McGehee, Role, 1995;Albuquerque et al., 2009).Наибольшей плотности нХР достигают на гребнях складок концевойпластинки примерно 10000/мкм2 (общее количество на один синапс достигает107).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
