Диссертация (1144759), страница 11
Текст из файла (страница 11)
С-конец дистрофина или утрофина (дистрофинсвязанныйбелок)дистрогликанами,связанскомплексомсаркогликанами,гликопротеиновсаркоспаном,(формируемогосинтрофинамиидистробревином), которые контактируют с трансмембранными компонентами исвязаны с базальной мембраной с помощью суб-сарколеммального цитоскелета.Белковый комплекс дистрофина ассоциирован с рапсином (белок массой 43кДа), который ко-локализован и связан с нХР, а также включает другие белкицитоскелета: синтрофин, β-спектрин, F-актин (Rafael, Brown, 2000; Ghedini et al.,2008). Этот белковый комплекс считается ответственным за стабилизацию ифункционирование нервно-мышечного синапса за счет поддержания структурыконцевой пластинки и стабильности распределения нХР, однако роль отдельныхцитоскелетных белков в этом процессе до конца не определена (Rafael, Brown,582000). Ассоциация дистрофин-гликопротеинного комплекса с сигнальнымимолекулами может свидетельствовать о роли этого белкового комплекса впреобразовании клеточных сигналов (Ghedini et al., 2008; Pilgram et al., 2010;Lawler, 2011; Sancar et al., 2011).Точечная мутация в гене дистрофина в Х-хромосоме является причинойразвития генетического дефекта мышц – миодистрофии Дюшена у человека.Хорошо изученной генетически гомологичной моделью для изучения этогозаболевания является мутантная линия мышей mdx (Partridge, 2010).
В мышцахбольных миодистрофией и у носителей данного заболевания обнаружен дефицитдистрофина, а экспрессия атрофина в волокнах значительно повышена (Pearce etal., 1993). Дефицит дистрофина приводит к нестабильности мембраны иувеличениюнедостаткомчувствительностидистрофинакмеханическимобнаруживаютсястрессам.поврежденияВмышцахсвсарколемме,приводящие к утечке ионов и белков, что приводит к замещению мышечнойткани на фиброзную.
Такая мышца теряет способность к нормальномусокращению, заметно уменьшается диаметр мышечных волокон и снижается ихмасса (Han et al., 2005; Ghedini et al., 2008).В нормальных мышечных волокнах мышей нХР в концевой пластинкераспределены в виде регулярных и непрерывных ветвей, количество такихфрагментов составляет от 3 до 5. У mdx мышей наблюдается дефрагментацияраспределения нХР и появление многочисленных рецепторных островков(Marques et al., 2007; van der Pijl et al., 2016). У мышей mdx обнаружены такжедругие структурные изменениями в нервно-мышечном синапсе: увеличениеветвления нервных терминалей, редукция постсинаптической складчатости,увеличениеразмеровсинаптическойщелииувеличениеэкспрессиивнесинаптических нХР (Соколова и др., 2010; Carlson, Roshek, 2001; O'Brien et al.,2001; Ghedini et al., 2008).Электрогенез скелетной мышцы у мышей mdx до сих пор остается малоизученным, и имеются лишь единичные работы по этому вопросу (Carlson,Roshek, 2001; Canato et al., 2010; Miles et al., 2011).
Литературные данные об59активности Na,K-АТФазы скелетной мышцы у мышей mdx противоречивы (Hirnet al., 2008; Miles et al., 2011).Можно предположить, что дефицит дистрофина приводит к повреждениямсарколеммальной мембраны и как следствие к нарушению функциональной связимежду нХР и Na,K-АТФазой. На сегодняшний день нет никаких разработок поданной проблеме.**************************Хотя2-изоформаNa,K-АТФазыдоминируетвскелетноймышце,локализации и функционирования её различных пулов во многом неясны. Внастоящее время выявлена специализированная роль локализованного в Тсистеме пула 2-изоформы в поддержании мышечной работоспособности приинтенсивной нагрузке (Radzyukevich et al., 2013; DiFranco et al., 2015).
Однакоособенности локализации, функционирования и регуляции 2-изоформы Na,KАТФазы в концевой пластинке не исследованы. Не выяснена изоформспецифичность участия Na,K-АТФазы в механизме генерации локальнойгиперполяризациимембраныконцевой,неизученафункционального взаимодействия Na,K-АТФазы с холестерином.возможность603.2.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ3.2.1. Локализация и функционирование 2-изоформы Na,K-АТФазы вконцевой пластинкеПриисследованиилокализации2-изоформыNa,K-АТФазывдиафрагмальной мышце мыши C57Bl/6 и в m. soleus крысы нами былоустановлено, что сигналы от меченого -BTX (красный канал, нХР) и OuabainBodipy (зеленый канал, 2-изоформа) сконцентрированы в области концевойпластинки и совпадают при наложении (рис. 3.2).Рис.
3.2. Флуоресцентные изображения локализации нХР и 2-изоформыNa,K-АТФазы в концевой пластинке диафрагмальной мышцы мыши C57Bl/6 (А)и m. soleus крысы (Б). Двойное мечение α-бунгаротоксином (нХР, красный канал)и Вodipy-conjugated ouabain (2 Na,K-АТФаза, зеленый канал). Масштаб 10 мкм.НаграфикахсправапоказанысоответствующиевеличиныМППв61постсинаптическом (1) и внесинаптическом (2) районах мембраны. Каждоезначение – измерение МПП в 256 – 363 волокнах; 12 – диафрагм и 8 m.
soleus.В обеих мышцах наблюдается небольшая, но высокодостоверная (р < 0.01)локальная гиперполяризация постсинаптической мембраны величиной 3 – 4 мВ(рис. 3.2), что хорошо соответствует литературным данным (Vyskocil et al., 1983;Nikolsky et al., 1994).Для определения электрогенной активности изоформ Na,K-АТФазы в разныхучастках сарколеммы, использовали разработанный нами физиологический тест.Проточный физиологический раствор последовательно заменяли на раствор,содержащий уабаин в концентрациях 1 мкМ и затем 500 мкМ, которые блокируютуабаин-чувствительную 2- и уабаин-резистентную 1- изоформы Na,K-АТФазысоответственно (Krivoi et al., 2003) (см.
также Методику). В диафрагмальноймышце крысы уабаин в концентрации 1 мкМ вызывал деполяризацию мембраныдо уровня около –73 мВ. Электрогенную активность 2-изоформы определяли,как разницу между значениями МПП до и через 30 мин действия 1 мкМ уабаина.Добавление 500 мкМ уабаина вызывало дополнительную деполяризацию волокондо уровня МПП около –61 мВ. Электрогенную активность 1-изоформыопределяли, как разницу между величинами МПП до и через 30 мин действия 500мкМ уабаина (рис.
3.3).Исходные значения МПП составили: в постсинаптическом районе –81.5 ± 0.4мВ (154 волокна) и во внесинаптическом районе –78.0 ± 0.4 мВ (184 волокна)(рис. 3.3). Таким образом, локальная гиперполяризация постсинаптическоймембраны в диафрагме крысы составила 3.5 ± 0.6 мВ (p < 0.01).
Соответственновеличиныэлектрогеннойактивность2-изоформыNa,K-АТФазывпостсинаптическом и внесинаптическом районах мембраны составили –7.7 ± 0.6мВ и –5.4 ± 0.6 мВ. В присутствии 1 мкМ уабаина постсинаптическая ивнесинаптическая мембрана были деполяризованы до примерно одинаковогоуровня около –73 мВ, локальная гиперполяризация мембраны исчезала (рис.
3.3).62Электрогенные активности 1-изоформы Na,K-АТФазы в постсинаптическом ивнесинаптическом районах мембраны не различались и составили соответственно–11.7 ± 0.6 мВ и –11.2 ± 0.6 мВ.Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что локальнаягиперполяризация постсинаптической мембраны в диафрагме крысы обусловленаповышенной электрогенной активностью 2-изоформы Na,K-АТФазы в этомрайоне сарколеммы.Уабаин-601 мкМ500 мкММПП, мВ-651-70-7512212-80**015304560Время, минРис.
3.3. Электрогенные активности 1- и 2-изоформ Na,K-АТФазы впостсинаптическом (1) и внесинаптическом (2) районах сарколеммы диафрагмыкрысы. Горизонтальной линией обозначено время присутствия уабаина врастворе; вертикальными стрелками отмечены моменты добавления 1 мкМ и 500мкМ уабаина. Справа: электрогенные вклады 1- (черные столбцы) и 2- (серыестолбцы) изоформ Na,K-АТФазы. Каждое значение МПП представляет собойсреднее значение, полученное в более чем 150 волокнах. ** p < 0.01.63Аналогичный результат был получен нами при исследовании механизмалокальной гиперполяризации постсинаптической мембраны в диафрагмальноймышце мыши C57Bl/6 и в m. soleus крысы (рис. 3.4).Рис. 3.4. Электрогенные активности 1- (темные столбцы) и 2- (светлыестолбцы) изоформ Na,K-АТФазы в постсинаптическом (1) и внесинаптическом (2)районах сарколеммы в диафрагмальной мышце мыши C57Bl/6 (А) и в m.
soleusкрысы (Б). Каждое значение – измерение МПП в 100 – 150 волокнах. ** p < 0.01.Важно отметить, что локальная гиперполяризация постсинаптическоймембраны в диафрагме крысы полностью блокировалась 50 нМ уабаина безизменений величины МПП во внесинаптическом районе сарколеммы (рис. 3.5 А).При этом в постсинаптическом районе электрогенная активность 2-изоформыснижалась почти вдвое, но достоверно не изменялась во внесинаптическомрайоне мембраны (рис. 3.5 Б). Эти факты можно объяснить тем, что ранее былопредсказано наличие двух пулов 2-изоформы Na,K-АТФазы, блокируемыхуабаином с константами 150 нМ и 9 нМ, причем только пул с более высокимсродством к уабаину функционально взаимодействует с нХР (Krivoi et al., 2006).Мы полагаем, что именно этот пул 2-изоформы (2* на рис.
3.5 Б) активируетсянеквантовым АХ и отвечает за локальную гиперполяризацию постсинаптическоймембраны и именно он блокируется уабаином в концентрации 50 нМ.64Рис. 3.5. Величины МПП (А) и соответствующие электрогенные активности1- и 2-изоформ Na,K-АТФазы (Б) в диафрагмальной мышце крысы в контролеи при действии 50 нМ уабаина. 1 – постсинаптический и 2 – внесинаптическийрайоны мембраны.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
