Диссертация (1144759), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Кроме того, эти лигандыспособны по-разному сдвигать равновесие между состояниями покоя идесенситизации нХР, за счет различного влияния на константу изомеризациирецептора (Boyd, Cohen, 1984; Song, Pedersen, 2001; Ryan et al., 2002).По ряду данных проадифен сдвигает равновесие в сторону десенситизациинХР (Song, Pedersen, 2000; Ryan et al., 2002). В наших опытах проадифен вдиапазонеконцентрациймкМ5–50мкМвызывалдозо-зависимуюгиперполяризацию (p < 0.01) внесинаптического района мышечных волокондиафрагмы крысы (рис. 3.11 А, Б). Напротив, гиперполяризующий эффект АХ(100 нМ), добавляемого на фоне разных концентраций проадифена, был темменьше, чем больше концентрация проадифена и полностью отсутствовал нафоне 50 мкМ проадифена (рис. 3.11 А, Б).
Эти наблюдения позволяютпредположить, что гиперполяризующие эффекты проадифена и АХ не аддитивны,то есть имеют общий механизм реализации. Это предположение подтверждаетсятем, что специфический блокатор Na,K-АТФазы уабаин в концентрации 50 нМ(30 мин преинкубации) предотвращал гиперполяризующее действие проадифена(рис. 3.11 А), что свидетельствует о вовлечении уабаин-чувствительной 2изоформыпроадифена.Na,K-АТФазывреализациюгиперполяризующегоэффекта72Aуабаин 50 нМпроадифен 50 мкМАХ 100 нМ-74МПП, мВ-76-78-80-82-30-77-15015304560Время, минБ-78МПП, мВ-79-80AIH-81-82-830-610-5-41010Проадифен, MРис. 3.11.
Изменение величины МПП мышечных волокон диафрагмы крысы(внесинаптический район) при действии проадифена. А – Действие проадифена вконцентрации 50 мкМ. Светлые кружки – действие самого проадифена; темныекружки – действие АХ (100 нМ) на фоне проадифена; треугольники – действиепроадифена на фоне уабаина в концентрации 50 нМ (30 мин преинкубации).Времяприсутствияврастворепроадифена,АХиуабаинапоказаносоответствующими горизонтальными полосками. Б – Изменение величины МППв присутствии различных концентраций проадифена (30 мин преинкубации,светлые кружки) и через 15 мин после добавления 100 нМ АХ (темные кружки).Величины вызываемой АХ гиперполяризации (ACh-induced hyperpolarization –73AIH) определялись как разница МПП перед добавлением АХ и через 15 мин егодействия на фоне проадифена в данной концентрации – показаны вертикальнымистрелками.
Средние значения измерений МПП в более чем 100 мышечныхволокнах.Далее мы использовали другой неконкурентный блокатор нХР, QX-222который в концентрации 50 мкМ оказывал сходное с проадифеном действие, тоесть сам по себе вызывал статистически значимую гиперполяризацию мышечныхволокон величиной около 3 мВ (р < 0.01). На фоне 50 нМ уабаина этот эффектотсутствовал (рис.
3.12). Добавление АХ (100 нМ) на фоне QX-222, как и в случаес проадифеном, было неэффективным (рис. 3.12).уабаин 50 нМQX-222 50 мкМ-74АХ 100 нММПП, мВ-76-78-80-82-30-150153045607590Время, минРис.3.12.ДинамикаМППмышечныхволокондиафрагмыкрысы(внесинаптический район) при действии QX-222 в концентрации 50 мкМ.Светлые кружки – действие самого QX-222 (4 мышцы, 143 – 163 мышечныхволокна); темные кружки – действие QX-222 на фоне уабаина в концентрации 50нМ (30 мин преинкубации) (4 мышцы, 99 – 106 мышечных волокон).
АХдобавляли на фоне стабильного гиперполяризующего действия QX-222. Времяприсутствия в растворе веществ показано соответствующими горизонтальнымиполосками.74Важноотметить,чтоQX-222вызывалгиперполяризациютольковнесинаптической мембраны, но не влиял на величину МПП постсинаптическоймембраны (рис. 3.13).
Аналогичная картина наблюдалась нами ранее прииспользовании 100 нМ никотина (рис. 3.7).QX-22250 мкМКонтроль-70МПП, мВ-72-74-76-78-80-82**Рис. 3.13. Изменение величины МПП в постсинаптическом (темные столбцы)и внесинаптическом (светлые столбцы) районах сарколеммы диафрагмы крысыпри действии 50 мкМ QX-222.**p < 0.01 по сравнению с соответствующимконтролем.
Средние значения измерений МПП в более чем 100 мышечныхволокнах.Этотвопроспостсинаптическаямыужемембраначастичноисходнообсуждаливыше.гиперполяризованаПосколькуотносительноостальной сарколеммы за счет активации Na,K-АТФазы неквантовым АХ,достигающим в синаптической щели постоянной концентрации 50 нМ (Vyskocil etal., 1983; Nikolsky et al., 1994; Vyskocil et al., 2009), можно полагать, что этодействие уже является насыщающим в отношении Na,K-АТФазы. Поэтому мы ненаблюдаемаддитивностигиперполяризующихэффектовэндогенногонеквантового АХ и применяемых нами агентов в постсинаптическом районемембраны.Тетракаин – другой неконкурентный блокатор нХР, в отличие от проадифенаи QX-222 препятствует развитию состояния десенситизации и стабилизирует нХР75в состоянии покоя (Boyd, Cohen, 1984).
Тетракаин (50 мкМ), в отличие от QX-222и проадифена, сам по себе не изменял величины МПП. Добавление АХ (100 нМ)на фоне тетракаина вызывало статистически значимую гиперполяризацию (p <0.01), однако ее развитие было медленнее по сравнению с обычно наблюдаемойгиперполяризацией при действии АХ (рис. 3.14).Рис.3.14.ДинамикаМППмышечныхволокондиафрагмыкрысы(внесинаптический район) при действии 50 мкМ тетракаина. Светлые кружки –действие самого тетракаина; темные кружки – действие АХ (100 нМ) на фонететракаина; треугольники – действие АХ (100 нМ) в растворе без тетракаина.Времяприсутствияврастворевеществпоказаносоответствующимигоризонтальными полосками.
** p < 0.01 изменение МПП после добавления АХ(треугольники) по сравнению с эффектом АХ на фоне тетракаина (темныекружки). Средние значения измерений МПП в 126 – 227 мышечных волокнах.Таким образом, результаты наших опытов противоречат предположению обионной природе функционального взаимодействия между нХР и 2-изоформойNa,K-АТФазы и механизма локальной гиперполяризации постсинаптическоймембраны.
Наиболее вероятным для осуществления взаимодействия этих белковявляется конформационный переход нХР в состояние десенситизации.763.2.3. Дистрофин и холинергическая модуляция Na,K-АТФазыВ формировании функционального комплекса нХР/2-изоформа Na,KАТФазы могут участвовать различные факторы молекулярного окружения.Одним из таких факторов может являться белок цитоскелета дистрофин,участвующий в организации постсинаптического скаффолда и кластеризации нХР(Rafael et al., 2000; Galbiati et al., 2001).
Эту возможность мы исследовали намутантной линии мышей mdx, мышцы которых характеризуются дефицитомсинтеза дистрофина. В качестве контроля использовали мышей C57Bl/6.Возраст животных в обеих группах составлял около 6 месяцев.Выше нами было показано, что в диафрагмальной мышце мыши C57Bl/6сигналы от меченого -BTX (красный канал, нХР) и Ouabain-Bodipy (зеленыйканал, 2-изоформа) сконцентрированы в области концевой пластинки исовпадают при наложении (см. рис. 3.2). Аналогичная локализация нХР и 2изоформы наблюдалась и в диафрагмальной мышце мыши mdx, несмотря навыраженную дефрагментацию в распределении нХР концевой пластинки (рис.3.15), которая характерна для мышей mdx (Marques et al., 2007; van der Pijl et al.,2016).Рис. 3.15. Флуоресцентные изображения локализации нХР и 2-изоформыNa,K-АТФазы в концевой пластинке диафрагмальной мышцы мыши mdx.Двойное мечение α-бунгаротоксином (нХР, красный канал) и Вodipy-conjugatedouabain (2 Na,K-АТФаза, зеленый канал).
Масштаб 10 мкм.77В диафрагмальных мышцах контрольных мышей C57Bl/6 величина МПП впостсинаптическом районе мембраны была негативнее (р < 0.01) по сравнению свнесинаптическим районом: соответственно –81.4 ± 0.5 мВ (173 волокон) и –78.0± 0.4 мВ (193 волокна) (рис. 3.16). Таким образом, величина локальнойгиперполяризации постсинаптической мембраны составила 3.4 ± 0.6 мВ.У мышей mdx наблюдалось общее снижение величины МПП вовнесинаптическом и в постсинаптическом районах до –74.4 ± 0.5 мВ (118волокон) и –75.1 ± 0.6 мВ (106 волокон) соответственно.
Локальнаягиперполяризация постсинаптического района мембраны отсутствовала (рис.3.16).Рис. 3.16. Влияние никотина (100 нМ, 30 – 60 мин инкубации) на МППмышечных волокон диафрагмы мышей C57Bl/6 (контроль) и мышей mdx вовнесинаптическом (светлые столбцы) и постсинаптическом (темные столбцы)районах мембраны. Каждое значение МПП представляет собой среднее значениепо множеству волокон. Мыши C57Bl/6: в контроле – 8 мышц, 173 волокна впостсинаптическом и 193 волокна во внесинаптическом районах; в опытах сникотином (те же мышцы) – 287 волокон в постсинаптическом и 302 волокна вовнесинаптическом районах. Мышы mdx: в контроле – 6 мышц, 106 волокон впостсинаптическом и 118 волокон во внесинаптическом районах; в опытах сникотином (те же мышцы) – 110 волокон в постсинаптическом и 118 волокон во78внесинаптическом районах.
** p < 0.01 – различие между указанными районамимембраны.Наблюдаемое нами снижение электрогенеза мышечных волокон у мышейmdx согласуется с данными литературы (Canato et al., 2010; Miles et al., 2011).Механизм этого феномена до сих пор не ясен. Важным фактором здесь можетбыть увеличение входа натрия вследствие нарушений в работе потенциалозависимых каналов Nav1.4 типа (Hirn et al., 2008), накопление внутриклеточногокальция (Allen et al., 2010), а также снижение активности Na,K-АТФазы (Miles etal., 2011).В литературе нет данных об электрогенезе различных районов мембраныскелетных мышечных волокон мышей mdx.
В наших опытах впервыенаблюдалось, что у мышей mdx не просто развивается деполяризация мышечныхволокон, но и исчезает локальная гиперполяризация мембраны концевойпластинки, которую мы объясняем функциональным взаимодействием междунХР и α2-изоформой Na,K-АТФазы. Этот факт позволяет предположить участиедистрофина в реализации этого взаимодействия.Чтобы проверить это предположение, мы провели опыты с применениемникотина в концентрации 100 нМ, который специфически активирует 2изоформу Na,K-АТФазы (см. п. 5.2.2, рис. 5.13).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
