Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1144759), страница 9

Файл №1144759 Диссертация (Функциональная гетерогенность Na,K-АТФазы в скелетной мышце) 9 страницаДиссертация (1144759) страница 92019-06-29СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 9)

Гель, не содержащий никотин, использовали в качестве контроля.46В ходе экспериментов регистрировали значение МПП мышечных волокони сократительные характеристики изолированной m. soleus крысы у контрольныхживотных (гель без никотина) и у животных в условиях хронического локальноговведения никотина.Ввидунекоторыхметодическихтрудностейопределитьточнуюконцентрацию никотина в образцах геля не представлялось возможным.Поэтомудляопределенияприготовленныхтестирования,образцовподробноеуровнягеля,никотина,применялиописаниекоторойдиффундирующегофизиологическуюизложеновизмодельрезультатахисследования (глава 4, п. 4.2.1).2.10.2.

Инъекции никотинаДля хронического введения никотина применяли следующий протокол:крысам трижды в день делали подкожные инъекции раствора никотина по 200 мклв области шеи из расчета дозы 6 мг/кг/день, по аналогии с другими протоколами(Wang et al., 1994; Mayhan et al., 2010).

Применяли (-)Nicotine Hydrogen Tartrate(Sigma), приготовленный на стерильном изотоническом 0.9% растворе NaCl.Контрольным животным в том же объеме вводили изотонический 0.9% растворNaCl. Инъекции проводили в течение 2-х недель. Затем ежедневно в опыт бралисьпо одной крысе из каждой группы. Оставшимся продолжали инъекции, то естьсрок воздействия никотина составил 14 – 21.2.10.3. Пероральное применение никотинаВ другой серии экспериментов применяли хроническое введение никотина спитьевой водой, которая была единственным источником жидкости (Larsson et al.,1988; Sparks, Pauly, 1999; Brunzell et al., 2003). Контрольных и опытных животныхсодержали в разных клетках. Питьевая вода, которую получали обе группыживотных, содержала 2% сахарина (Sparks, Pauly, 1999).

В воду дляэкспериментальных животных добавляли (-)никотин тартрат в концентрации 60мг/л (Larsson et al., 1988). Крысы получали никотин в течение 21 – 31 суток, послечего извлекали исследуемую мышцу. Как правило, проводили по дваэксперимента в день на одной контрольной и одной экспериментальной крысе.47Оставшиеся животные из экспериментальной группы продолжали получатьникотин.2.11.

Обработка результатов и используемые веществаРегистрируемыеответыоцифровывалисьаналого-цифровымипреобразователями (частота квантования для мышечных сокращений – 5000/с,для МПП, Rвх и ПД – 44000/с) и далее анализировались на персональномкомпьютере. При измерении ПД регистрировали максимальную амплитуду ПД,время нарастания (10 – 90 % от максимальной амплитуды), длительностьполуспада, площадь под кривой ПД. При регистрации мышечных сокращенийизмерялись сила сокращения, длительность и скорость фазы нарастания, времяполурасслабления, площадь под кривой сокращения.Статистическую обработку данных проводили с помощью программORIGIN 6.1., Microsoft Excel, GraphPad Prizm5.

В тексте и на рисунках приведенысредние значения ± стандартная ошибка среднего. Достоверность различияоценивали с помощью t-критерия Стьюдента при условии нормальногораспределения в выборках, либо однофакторного дисперсионного анализаANOVA (программное обеспечение ORIGIN 6.1). Критерий КолмогороваСмирноваиспользовалидляоценкинормальностираспределенияидостоверности различия кумулятивных кривых.Растворы приготовляли на основе бидистиллированной воды из реактивовфирмы Sigma. В опытах применяли уабаин, ацетилхолин, никотин ((- nicotinehydrogen tartrate), проадифен, QX-222, тетракаин, N-methyl-d-glucamine chloride –все фирмы Sigma.Маринобуфагенин – ингибитор Na,K-АТФазы, выделенный из паротидныхжелез Bufo marinus, был любезно предоставлен д-ром А.Я.

Багровым (Институтэволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова, РАН; National Instituteof Aging, National Institutes of Health, Baltimore, USA). Фирмы-производители рядавеществ, используемых в данной работе, внесены в соответствующие методики.48ГЛАВА 3. ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ 2-ИЗОФОРМЫNa,K-АТФазы В КОНЦЕВОЙ ПЛАСТИНКЕ3.1. ВВЕДЕНИЕ3.1.1. Na,K-АТФаза и гарантийный фактор нервно-мышечной передачиУстановлено, что 2-изоформа Na,K-АТФазы доминирует и её фракциядостигает более 80 % от общего количества Na,K-АТФазы в скелетной мышце(Orlowski, Lingrel, 1988; He et al., 2001), однако локализация и функционированиееё различных пулов во многом неясны. В настоящее время подробно исследованлокализованный в Т-системе пул 2-изоформы и выявлена его важная роль вподдержании мышечной работоспособности при интенсивной нагрузке, когдапроисходит накопление К+ в узких пространствах Т-системы (Radzyukevich et al.,2013; DiFranco et al., 2015).

Однако особенности локализации, функционированияи регуляции 2-изоформы Na,K-АТФазы в постсинаптической области мембраны(концевая пластинка) не исследованы.Поддержание определенного уровня МПП мышечных волокон являетсяобязательным условием нормального функционирования скелетной мышцы.Деполяризация мембраны ведет к инактивации Na+ каналов, уменьшениювозбудимости, замедлению временного хода потенциалов действия и скорости ихпроведения, а также к нарушению электромеханического сопряжения (Wood,Slater 2001; Miles et al., 2011).

Наиболее серьезны последствия нарушенийэлектрогенеза для околосинаптической области сарколеммы, где происходиттрансформациялокальногопотенциалаконцевойпластинкивраспространяющийся потенциал действия.Даже относительно небольшая по величине, но длительная деполяризациямембраны концевой пластинки ведет к медленной инактивации значительнойфракции локализованных там натриевых каналов. Это повышает порог генерации49мышечного потенциала действия и снижает гарантийный фактор нервномышечной передачи, гиперполяризация мембраны оказывает противоположноедействие (Ruff, 2011). В связи с этим особое значение приобретает тот факт, чтомембрана концевой пластинки скелетных мышечных волокон млекопитающихгиперполяризована на 2 – 4 мВ по сравнению с внесинаптической мембраной.

Этулокальную гиперполяризацию рассматривают как важный фактор структурнофункциональной организации нервно-мышечного синапса. Как установленоработами акад. Е.Е. Никольского и соавторов, локальная гиперполяризациявозникает за счет активации электрогенного Na,K-насоса (Vyskocil et al., 1983;Nikolsky et al., 1994), однако механизм этого эффекта и его изоформспецифичность не были исследованы. По ряду данных причиной повышенияэлектрогеннойактивностиNa,K-АТФазыявляетсянегидролизованныйацетилхолин (АХ), постоянно присутствующий в синаптической щели внаномолярной концентрации даже при активной ацетилхолинэстеразе (Vyskocil etal., 2009; Nikolsky et al., 1994). Предполагается, что источником этого АХ восновном является медиатор, выделяющийся из моторного нервного окончания ииз мышечных волокон в неквантовой форме (Маломуж, Никольский, 2010). Этомогут быть также отдельные молекулы АХ, сохранившиеся в синаптической щелипосле нервной активности.Наиболее вероятной причиной такого гиперполяризующего действия АХявляется функциональное взаимодействие между нХР и Na,K-АТФазой.Рассматривают две модели такого взаимодействия (Кривой, 2012; Matchkov,Krivoi, 2016).Первая модель основана на том, что функциональное взаимодействие междунХР и Na,K-АТФазой опосредовано Na+, входящим через открытые каналы нХР.ВсоответствиисобщепринятымипредставленияминХРосуществляетконформационные переходы между закрытым, открытым и десенситизированнымсостояниями, описываемые вероятностными закономерностями (Monod, 1965;Karlin, 1967; Changeux, Edelstein, 2001).

Для активации нХР и открывания ионногоканала рецептора требуются микромолярные концентрации АХ. В зонах действия50одиночных квантов локальная концентрация АХ на очень короткое времядостигает насыщающей концентрации 10–2 – 10–4 М, что обеспечиваетнаибольшую эффективность его взаимодействия с нХР. Активация нХР приводитк открыванию ионного канала рецептора и деполяризации мембраны клетки.Однако за счет функциональной связи нХР с Na,K-АТФазой холинергическиеагонисты способны вызывать противоположный эффект – гиперполяризациюмембраны.

В частности, в нейронах после спайковой активности или последействия АХ может наблюдаться следовая гиперполяризация мембраны. Вганглионарных нейронах крысы устойчивая (длительностью до минут) следоваягиперполяризация после действия микромолярных концентраций АХ, в основномосуществляется за счёт входящих через каналы нХР ионов натрия, активирующихNa,K-АТФазу (рис. 3.1). Предполагается, что такая гиперполяризация можетслужить механизмом саморегуляции возбудимости мембраны и интенсивностиразрядов постсинаптических нейронов (Park et al., 2010).Рис.

3.1. Модель функционального взаимодействия между нХР и Na,KАТФазой, проявляющегося в виде следовой гиперполяризации мембраныганглионарных нейронов крысы после спайковой активности или после действиямикромолярных концентраций АХ.Основным является механизм активацииNa,K-АТФазы входящими через каналы нХР ионами натрия (Из: (Park et al.,2010).51Вторая модель основана на предположении о том, что функциональноевзаимодействие нХР и Na,K-АТФазы в скелетной мышце обусловлено прямыммолекулярным взаимодействием этих белков (Krivoi et al., 2006; Heiny et al., 2010;Matchkov, Krivoi, 2016).3.1.2. Молекулярный комплекс никотинового холинорецептора и Na,KАТФазыВ настоящее время выявлены функциональные и межмолекулярныевзаимодействия между Na,K-АТФазой и самыми разнообразными белками(рецепторы, транспортеры и др.), вовлеченными в регуляцию синаптическойфункции (Hazelwood et al., 2008; Matos et al., 2013; Illarionava et al., 2014).Подтверждается и возможность молекулярной связи Na,K-АТФазы с нХР.

Так,при выделении нХР из мембраны электрического органа Torpedo marmorata былопоказано, что даже в препаратах высокой степени очистки нХР остаетсяассоциированным с -субъединицей Na,K-АТФазы (Elfman et al., 1982, Carr et al.,1989; Blanton et al., 2001), что свидетельствует о возможности молекулярной связимежду этими белками. Показано, что уабаин в наномолярном диапазонеконцентраций модулирует кинетику связывания флуоресцентного лиганда дансилС6-холина с нХР (спектроскопический анализ кинетики связывания методомостановленногопотока)вмембранныхпрепаратахTorpedocalifornica,содержащих нХР и Na,K-АТФазу. С другой стороны, связывание дансил-С6холина с нХР модулирует связывание уабаина с Na,K-АТФазой.

(Кривой и др.,2006б; Krivoi et al., 2006; Heiny et al., 2010).Результатыэтихопытовпозволяютпредположить,чтоизменениеконформации одного белка после связывания с ним лиганда вызывает изменениесвойств сопряженной молекулы, что указывает не только на функциональную, нои на молекулярную связь между нХР и Na,K-АТФазой. Показана аналогичнаяфункциональная и молекулярная реципрокная связь между Na,K-АТФазой ирецептором дофамина (Hazelwood et al., 2008).52Важно отметить, что в опытах на клеточных моделях (культура С2С12,ооциты Xenopus с экспрессировыми нХР) кратковременная аппликация АХ внизкой концентрации вызывала только деполяризацию мембраны этих клеток(Кривой и др., 2004). Сравнение этих результатов с данными опытов наизолированной диафрагме крысы и препарате из электрического органа Torpedo(зрелые ткани) наводит на мысль, что образование функционального комплексанХР с Na,K-АТФазой требует наличия определенных факторов или выполненияопределенных условий, которые характерны только для зрелой мышечной клетки,но отсутствуют в таких моделях, как клетки С2С12 или ооциты.

Характеристики

Тип файла
PDF-файл
Размер
4,16 Mb
Предмет
Высшее учебное заведение

Список файлов диссертации

Свежие статьи
Популярно сейчас
Зачем заказывать выполнение своего задания, если оно уже было выполнено много много раз? Его можно просто купить или даже скачать бесплатно на СтудИзбе. Найдите нужный учебный материал у нас!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6392
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее