Диссертация (1144759), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Гель, не содержащий никотин, использовали в качестве контроля.46В ходе экспериментов регистрировали значение МПП мышечных волокони сократительные характеристики изолированной m. soleus крысы у контрольныхживотных (гель без никотина) и у животных в условиях хронического локальноговведения никотина.Ввидунекоторыхметодическихтрудностейопределитьточнуюконцентрацию никотина в образцах геля не представлялось возможным.Поэтомудляопределенияприготовленныхтестирования,образцовподробноеуровнягеля,никотина,применялиописаниекоторойдиффундирующегофизиологическуюизложеновизмодельрезультатахисследования (глава 4, п. 4.2.1).2.10.2.
Инъекции никотинаДля хронического введения никотина применяли следующий протокол:крысам трижды в день делали подкожные инъекции раствора никотина по 200 мклв области шеи из расчета дозы 6 мг/кг/день, по аналогии с другими протоколами(Wang et al., 1994; Mayhan et al., 2010).
Применяли (-)Nicotine Hydrogen Tartrate(Sigma), приготовленный на стерильном изотоническом 0.9% растворе NaCl.Контрольным животным в том же объеме вводили изотонический 0.9% растворNaCl. Инъекции проводили в течение 2-х недель. Затем ежедневно в опыт бралисьпо одной крысе из каждой группы. Оставшимся продолжали инъекции, то естьсрок воздействия никотина составил 14 – 21.2.10.3. Пероральное применение никотинаВ другой серии экспериментов применяли хроническое введение никотина спитьевой водой, которая была единственным источником жидкости (Larsson et al.,1988; Sparks, Pauly, 1999; Brunzell et al., 2003). Контрольных и опытных животныхсодержали в разных клетках. Питьевая вода, которую получали обе группыживотных, содержала 2% сахарина (Sparks, Pauly, 1999).
В воду дляэкспериментальных животных добавляли (-)никотин тартрат в концентрации 60мг/л (Larsson et al., 1988). Крысы получали никотин в течение 21 – 31 суток, послечего извлекали исследуемую мышцу. Как правило, проводили по дваэксперимента в день на одной контрольной и одной экспериментальной крысе.47Оставшиеся животные из экспериментальной группы продолжали получатьникотин.2.11.
Обработка результатов и используемые веществаРегистрируемыеответыоцифровывалисьаналого-цифровымипреобразователями (частота квантования для мышечных сокращений – 5000/с,для МПП, Rвх и ПД – 44000/с) и далее анализировались на персональномкомпьютере. При измерении ПД регистрировали максимальную амплитуду ПД,время нарастания (10 – 90 % от максимальной амплитуды), длительностьполуспада, площадь под кривой ПД. При регистрации мышечных сокращенийизмерялись сила сокращения, длительность и скорость фазы нарастания, времяполурасслабления, площадь под кривой сокращения.Статистическую обработку данных проводили с помощью программORIGIN 6.1., Microsoft Excel, GraphPad Prizm5.
В тексте и на рисунках приведенысредние значения ± стандартная ошибка среднего. Достоверность различияоценивали с помощью t-критерия Стьюдента при условии нормальногораспределения в выборках, либо однофакторного дисперсионного анализаANOVA (программное обеспечение ORIGIN 6.1). Критерий КолмогороваСмирноваиспользовалидляоценкинормальностираспределенияидостоверности различия кумулятивных кривых.Растворы приготовляли на основе бидистиллированной воды из реактивовфирмы Sigma. В опытах применяли уабаин, ацетилхолин, никотин ((- nicotinehydrogen tartrate), проадифен, QX-222, тетракаин, N-methyl-d-glucamine chloride –все фирмы Sigma.Маринобуфагенин – ингибитор Na,K-АТФазы, выделенный из паротидныхжелез Bufo marinus, был любезно предоставлен д-ром А.Я.
Багровым (Институтэволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова, РАН; National Instituteof Aging, National Institutes of Health, Baltimore, USA). Фирмы-производители рядавеществ, используемых в данной работе, внесены в соответствующие методики.48ГЛАВА 3. ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ 2-ИЗОФОРМЫNa,K-АТФазы В КОНЦЕВОЙ ПЛАСТИНКЕ3.1. ВВЕДЕНИЕ3.1.1. Na,K-АТФаза и гарантийный фактор нервно-мышечной передачиУстановлено, что 2-изоформа Na,K-АТФазы доминирует и её фракциядостигает более 80 % от общего количества Na,K-АТФазы в скелетной мышце(Orlowski, Lingrel, 1988; He et al., 2001), однако локализация и функционированиееё различных пулов во многом неясны. В настоящее время подробно исследованлокализованный в Т-системе пул 2-изоформы и выявлена его важная роль вподдержании мышечной работоспособности при интенсивной нагрузке, когдапроисходит накопление К+ в узких пространствах Т-системы (Radzyukevich et al.,2013; DiFranco et al., 2015).
Однако особенности локализации, функционированияи регуляции 2-изоформы Na,K-АТФазы в постсинаптической области мембраны(концевая пластинка) не исследованы.Поддержание определенного уровня МПП мышечных волокон являетсяобязательным условием нормального функционирования скелетной мышцы.Деполяризация мембраны ведет к инактивации Na+ каналов, уменьшениювозбудимости, замедлению временного хода потенциалов действия и скорости ихпроведения, а также к нарушению электромеханического сопряжения (Wood,Slater 2001; Miles et al., 2011).
Наиболее серьезны последствия нарушенийэлектрогенеза для околосинаптической области сарколеммы, где происходиттрансформациялокальногопотенциалаконцевойпластинкивраспространяющийся потенциал действия.Даже относительно небольшая по величине, но длительная деполяризациямембраны концевой пластинки ведет к медленной инактивации значительнойфракции локализованных там натриевых каналов. Это повышает порог генерации49мышечного потенциала действия и снижает гарантийный фактор нервномышечной передачи, гиперполяризация мембраны оказывает противоположноедействие (Ruff, 2011). В связи с этим особое значение приобретает тот факт, чтомембрана концевой пластинки скелетных мышечных волокон млекопитающихгиперполяризована на 2 – 4 мВ по сравнению с внесинаптической мембраной.
Этулокальную гиперполяризацию рассматривают как важный фактор структурнофункциональной организации нервно-мышечного синапса. Как установленоработами акад. Е.Е. Никольского и соавторов, локальная гиперполяризациявозникает за счет активации электрогенного Na,K-насоса (Vyskocil et al., 1983;Nikolsky et al., 1994), однако механизм этого эффекта и его изоформспецифичность не были исследованы. По ряду данных причиной повышенияэлектрогеннойактивностиNa,K-АТФазыявляетсянегидролизованныйацетилхолин (АХ), постоянно присутствующий в синаптической щели внаномолярной концентрации даже при активной ацетилхолинэстеразе (Vyskocil etal., 2009; Nikolsky et al., 1994). Предполагается, что источником этого АХ восновном является медиатор, выделяющийся из моторного нервного окончания ииз мышечных волокон в неквантовой форме (Маломуж, Никольский, 2010). Этомогут быть также отдельные молекулы АХ, сохранившиеся в синаптической щелипосле нервной активности.Наиболее вероятной причиной такого гиперполяризующего действия АХявляется функциональное взаимодействие между нХР и Na,K-АТФазой.Рассматривают две модели такого взаимодействия (Кривой, 2012; Matchkov,Krivoi, 2016).Первая модель основана на том, что функциональное взаимодействие междунХР и Na,K-АТФазой опосредовано Na+, входящим через открытые каналы нХР.ВсоответствиисобщепринятымипредставленияминХРосуществляетконформационные переходы между закрытым, открытым и десенситизированнымсостояниями, описываемые вероятностными закономерностями (Monod, 1965;Karlin, 1967; Changeux, Edelstein, 2001).
Для активации нХР и открывания ионногоканала рецептора требуются микромолярные концентрации АХ. В зонах действия50одиночных квантов локальная концентрация АХ на очень короткое времядостигает насыщающей концентрации 10–2 – 10–4 М, что обеспечиваетнаибольшую эффективность его взаимодействия с нХР. Активация нХР приводитк открыванию ионного канала рецептора и деполяризации мембраны клетки.Однако за счет функциональной связи нХР с Na,K-АТФазой холинергическиеагонисты способны вызывать противоположный эффект – гиперполяризациюмембраны.
В частности, в нейронах после спайковой активности или последействия АХ может наблюдаться следовая гиперполяризация мембраны. Вганглионарных нейронах крысы устойчивая (длительностью до минут) следоваягиперполяризация после действия микромолярных концентраций АХ, в основномосуществляется за счёт входящих через каналы нХР ионов натрия, активирующихNa,K-АТФазу (рис. 3.1). Предполагается, что такая гиперполяризация можетслужить механизмом саморегуляции возбудимости мембраны и интенсивностиразрядов постсинаптических нейронов (Park et al., 2010).Рис.
3.1. Модель функционального взаимодействия между нХР и Na,KАТФазой, проявляющегося в виде следовой гиперполяризации мембраныганглионарных нейронов крысы после спайковой активности или после действиямикромолярных концентраций АХ.Основным является механизм активацииNa,K-АТФазы входящими через каналы нХР ионами натрия (Из: (Park et al.,2010).51Вторая модель основана на предположении о том, что функциональноевзаимодействие нХР и Na,K-АТФазы в скелетной мышце обусловлено прямыммолекулярным взаимодействием этих белков (Krivoi et al., 2006; Heiny et al., 2010;Matchkov, Krivoi, 2016).3.1.2. Молекулярный комплекс никотинового холинорецептора и Na,KАТФазыВ настоящее время выявлены функциональные и межмолекулярныевзаимодействия между Na,K-АТФазой и самыми разнообразными белками(рецепторы, транспортеры и др.), вовлеченными в регуляцию синаптическойфункции (Hazelwood et al., 2008; Matos et al., 2013; Illarionava et al., 2014).Подтверждается и возможность молекулярной связи Na,K-АТФазы с нХР.
Так,при выделении нХР из мембраны электрического органа Torpedo marmorata былопоказано, что даже в препаратах высокой степени очистки нХР остаетсяассоциированным с -субъединицей Na,K-АТФазы (Elfman et al., 1982, Carr et al.,1989; Blanton et al., 2001), что свидетельствует о возможности молекулярной связимежду этими белками. Показано, что уабаин в наномолярном диапазонеконцентраций модулирует кинетику связывания флуоресцентного лиганда дансилС6-холина с нХР (спектроскопический анализ кинетики связывания методомостановленногопотока)вмембранныхпрепаратахTorpedocalifornica,содержащих нХР и Na,K-АТФазу. С другой стороны, связывание дансил-С6холина с нХР модулирует связывание уабаина с Na,K-АТФазой.
(Кривой и др.,2006б; Krivoi et al., 2006; Heiny et al., 2010).Результатыэтихопытовпозволяютпредположить,чтоизменениеконформации одного белка после связывания с ним лиганда вызывает изменениесвойств сопряженной молекулы, что указывает не только на функциональную, нои на молекулярную связь между нХР и Na,K-АТФазой. Показана аналогичнаяфункциональная и молекулярная реципрокная связь между Na,K-АТФазой ирецептором дофамина (Hazelwood et al., 2008).52Важно отметить, что в опытах на клеточных моделях (культура С2С12,ооциты Xenopus с экспрессировыми нХР) кратковременная аппликация АХ внизкой концентрации вызывала только деполяризацию мембраны этих клеток(Кривой и др., 2004). Сравнение этих результатов с данными опытов наизолированной диафрагме крысы и препарате из электрического органа Torpedo(зрелые ткани) наводит на мысль, что образование функционального комплексанХР с Na,K-АТФазой требует наличия определенных факторов или выполненияопределенных условий, которые характерны только для зрелой мышечной клетки,но отсутствуют в таких моделях, как клетки С2С12 или ооциты.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
